Автореферат (1091620), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Динамика роста (1), изменение содержания трегалолипидов (2) иповерхностного натяжения (3) культуральной среды бактерий штаммов X5 (а,б) и S67 (в,г) приросте на н-гексадекане при 26оС (а, в) и 10оС (б, г).При пониженной температуре (10оС) культивирование бактерий штамма X5приводило к снижению поверхностного натяжения с 72 мН/м до 32 мН/м, а штамма S67– до 45 мН/м. Несмотря на то, что поверхностная активность культуральной среды при910оС ниже, чем при 26оС, тем не менее, родококки способны продуцироватьвнеклеточные биосурфактанты даже при пониженной температуре.При температуре 26оС содержание трегалолипидов достигало максимальногозначения через 8 суток культивирования и составило 300 мг/л (для штамма X5) (рисунок1а, кривая 2) и 280 мг/л (для штамма S67) (рисунок 1в, кривая 2).
В то же времясодержание трегалолипидов в бесклеточном супернатанте бактерий, выращенных при10оС, было в три раза меньше, чем при 26оС (100 мг/л). Это может быть обусловленоснижением метаболизма микроорганизмов или адаптацией бактерий к росту нагидрофобных субстратах путем перераспределения биосурфактантов между средой иклеточной поверхностью. Кроме того, отсутствие прямой корреляции междусодержанием гликолипидов и поверхностным натяжением среды свидетельствует овкладе других веществ в увеличение поверхностной активности среды, например,продуктов частичной деградации гексадекана – гексадеканой кислоты, котораяобнаруживается в культуральной среде бактерий.Существенную роль в утилизации гидрофобных субстратов при низкихтемпературах могут играть такие механизмы, как продукция клеточносвязанныхбиосурфактантов; повышение гидрофобности клеточной поверхности; образованиевнутриклеточных липидных включений (Whyte et al., 1999).
Для выяснения роли этихмеханизмов в адаптации нефтеокисляющих бактерий R.erythropolis к низкимтемпературам мы проводили сравнительное определение гидрофобности клеточнойповерхности, содержания связанного гексадекана и липидного состава клеток взависимости от температуры культивирования.3.1.2 Влияние температуры на гидрофобность клеточной поверхности при росте на нгексадеканеПри росте на н-гексадекане, степень гидрофобности клеточной поверхностибактерий S67 составила 73% и 88% в экспоненциальной фазе роста при 26оС и 10оС, ибыла выше, чем у бактерий X5 - 63% при 26оС и 73% при 10оС (рисунок 2).Рисунок 2.
Степень гидрофобности клеточной поверхности бактерий R. erythropolis X5 (а) и R.erythropolis S67 (б) при росте на н-гексадекане в условиях температуры 26оС и 10оС.10При пониженной температуре степень гидрофобности клеточной поверхностиувеличивается на 10-15%, что способствует адгезии клеток к твердому субстрату. Ранеебыло показано, что у некоторых штаммов родококков степень гидрофобности клеточнойповерхности возрастает при снижении температуры культивирования до 17оС (Рубцовас соав., 2012). Вероятно, это является одним из механизмов выживания алканотрофныхродококков в холодных климатических условиях.
Высокая степень гидрофобностиклеточной поверхности у обоих штаммов указывает на то, что для этих бактерийхарактерен прямой контакт со слоем гидрофобного субстрата и пассивно-диффузныйего перенос в клетку. Следует отметить, что после выхода на стационарную фазу ростагидрофобность клеточной поверхности бактерий снижается как при 26˚С, так и при10˚С. Это может быть связано с перераспределением продуцируемых биосурфактантовмежду клеточной поверхностью и средой. Мы предполагаем, что гликолипиды,связанные первоначально с клеточной поверхностью, поступают в культуральнуюсреду, что приводит к увеличению содержания внеклеточных гликолипидов встационарной фазе роста бактерий (рисунок 1, кривая 2). Сравнительный анализ степенигидрофобности клеточной поверхности и содержания внеклеточных биосурфактантовпозволил выявить общую тенденцию уменьшения гидрофобности при увеличенииколичества продуцируемых биосурфактантов в культуральную среду.
Полученные намирезультаты согласуются с гипотезой о том, что биосурфактанты, продуцируемыемикроорганизмами, способны изменять поверхностные свойства клеток (Franzetti et al.,2008). Таким образом, клеточносвязанные гликолипиды могут способствовать адгезиибактерий на гидрофобных субстратах, что важно на первой стадии культивирования,когда в среде еще отсутствует продукты частичной деградации гексадекана и вторичныеметаболиты микроорганизмов. Приувеличении содержания внеклеточныхбиосурфактантов, которые обеспечивают псевдорастворение гидрофобных субстратов,снижается роль гидрофобного характера клеточной поверхности.
Гидрофобностьклеточной поверхности обеспечивается присутствием в клеточной стенке не толькогликолипидов. Известно, что состав клеточных липидов играет важную роль вадаптации бактерий к неблагоприятным условиям окружающей среды.3.2 Общее содержание и жирнокислотный состав липидов бактерий ивнеклеточных липидов3.2.1 Содержание липидов и связанного гексадекана, жирнокислотный составклеточных липидовОбщее содержание клеточных накопленных липидов у обоих штаммов,выращенных при 10˚С на гексадекане, значительно выше, чем у бактерий,культивируемых при 26˚С (рисунок 3).
Максимальное значение составляло 169 и 115мг/г(биомассы) (X5), 145 и 94 мг/г(биомассы) (S67) в экспоненциальной фазе роста при 10оС и26оС, соответственно. Полученные результаты согласуются с одним из механизмоввыживания бактерий в холодных условиях, который заключается в увеличении общих11липидов за счет повышения скорости их синтеза в клетках бактерий для запасанияэнергии и защиты клеток от замораживания.Рисунок 3. Содержание общих липидов бактерий R. erythropolis X5 (а) и R. erythropolis S67 (б),выращенных на н-гексадекане при 26оС и 10оСВ состав общих липидов входят мембранные липиды и внутриклеточные липиды,которые преимущественно образуют электронно-прозрачные включения в цитоплазмеклеток (п.3.3).
Эти включения, по разным данным, могут представлять собойтриацилглицериды (Alvarez et al., 1996), воска (Alvarez et al., 2013) или н-гексадекан(Mishra et al., 2012). Содержание связанного гексадекана в клетках S67 больше, чем уX5 как при комнатной (144 мкг/гбиомассы и 51 мкг/гбиомассы), так и при пониженнойтемпературе культивирования (49 мкг/гбиомассы и 7 мкг/гбиомассы).
Эти значения малы посравнению с общим содержанием липидов (около 0,01–0,02%), поэтому маловероятно,что гидрофобные включения в клетках бактерий, обнаруженные нами методомэлектронной микроскопии (п.3.3), представляют собой накопления гексадекана вклетках. Остаточные количества углеводорода в массе липидов можно объяснитьудерживанием его в клеточной стенке бактерий. При пониженной температуресодержание гексадекана в клетках бактерий уменьшается.
Это, вероятно, обусловленотвердым агрегатным состоянием алкана при 10оС, что затрудняет его связывание склеточной стенкой бактерий. Общее содержание жирных кислот сопоставимо ссуммарным содержанием липидов, выделенных из биомассы бактерий, и на три порядкабольше, чем содержание связанного гексадекана. На этом основании мы предполагаем,что липидные включения в клетках бактерий S67 и X5 представляют собойтриацилглицериды.Анализ жирнокислотного состава клеточных липидов показал, что основнойкомпонент – это гексадекановая кислота (36% при 26оС и 31% при 10оС для штамма X5;52% при 26оС и 33% при 10оС для штамма S67) (таблица 1), которая являетсяпромежуточным метаболитом гексадекана.12Таблица 1. Жирнокислотный состав клеточных липидов R.
erythropolis X5 иR. erythropolis S67 при росте на н-гексадеканеЖирные кислотыНасыщенные неразветвленныеОстановаяДекановаяДодекановаяТетрадекановаяПентадекановаяГексадекановаяГептадекановаяСуммарное содержаниеНасыщенные разветвленные12-метил-тридекановая14-метил-гексадекановая15-метил-гексадекановая4-4-диметил-гексадекановаяСуммарное содержаниеНенасыщенные9-гексадеценоваяСодержание, %Штамм X5Штамм S67оо26 С10 С26оС10оС613103648493165561251566-529813345-11141237181112110233319При пониженной температуре бактерии R.
erythropolis X5 синтезировали большененасыщенных жирных кислот (33% от общего состава жирных кислот), в то время какR. erythropolis S67 – разветвленные жирные кислоты (37%) (таблица 1). Октановая идекановаякислоты,которыеявляютсяструктурнымикомпонентамисукцинилтрегалолипидов, продуцируемых штаммами X5 и S67 (см. п.3.4.2),локализованы в клетках бактерий только при пониженной температуре.3.2.2 Жирнокислотный состав липидов, выделенных из бесклеточногосупернатантаВ культуральной среде бактерий S67 обнаруживается много гексадекановойкислоты (таблица 2).Таблица 2.
Жирнокислотный состав липидов, продуцируемых бактериями R.erythropolis X5 и R. erythropolis S67 в культуральную среду при росте на н-гексадеканеЖирнокислотный составлипидного экстрактаоктановаянонановаядекановаядодекановая12-метил-тридекановаягексадекановая4,4-диметилгексадекановаяR. erythropolis X526oC10oC17133864647159-R. erythropolis S6726oC10oC81141514046291013Это свидетельствует о том, что биодеградация гексадекана этими бактерияминачинается во внеклеточном или околоклеточном пространстве с образованиемпромежуточного метаболита – гексадекановой кислоты. Важно отметить, чтовнеклеточные липиды, продуцируемые обоими штаммами, содержат в значительномколичестве октановую и декановую кислоты, которые являются компонентамисукцинилтрегалолипидных биосурфактантов (п.3.4.2).3.3 Ультраструктурная организация клеток бактерий R. erythropolis X5 иR.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
