Диссертация (1091617), страница 2
Текст из файла (страница 2)
144Выводы ................................................................................................................ 152Список опубликованных научных работ по теме диссертации ............. 154Список литературы .......................................................................................... 1575Список сокращенийБПК – биохимическое потребление кислородаБТЭ – биотопливный элементBKM – Всероссийская коллекция микроорганизмовГГС – смесь глюкозы и глутаминовой кислотыДНК – дезоксирибонуклеиновая кислотаДДС – додецилсульфат натрияДДБС – додецилбензосульфат натрияИК – инфрокрасная спектроскопияМНПВО – многократно нарушенное полное внутреннее отражениеНАДН – НикотинамидадениндинуклеотидПВС – поливиниловый спиртПДК – предельно-допустимые концентрацииПНДФ – природоохранные нормативные документы федеративныеРАН – Российская академия наукУФ – ультрофиолетовыйХПК – химическое потребление кислородаЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислотаЯМР – ядерный магнитный резонансOECD – Организация Экономического Сотрудничества и РазвитияN-ВП – N-винилпирролидон6ВведениеВ настоящее время актуальной является разработка методов иаппаратуры для экспресс-анализа природных и сточных вод.
Списокобъектов, для которых данный тип анализа актуален, включает образцысточных вод (муниципальных и промышленных), образцы вод,полученныхиз объектовокружающейсреды(реки,озера,водохранилища). Одним из параметров, определяющим загрязненностьпроб воды, является биохимическое потребление кислорода (БПК). БПКотражает количество кислорода в мг/дм3, потребленное при окислениибиоразлагаемых органических соединений.Стандартная методикаопределения БПК требует инкубирования насыщенной кислородом пробыв течение 5, 10 или 20 суток (БПК5, БПК10 или БПК20, соответственно).
Всоответствии с мировой практикой эффективным подходом дляэкспресс оценки БПК является разработка биосенсоров, на основеиммобилизованных микроорганизмов, окисляющих широкий кругорганических веществ [1], за рубежом создан ряд коммерческих БПКбиосенсоров на основе биореакторов.Для создания биочувствительных элементов БПК-сенсоровиспользуютлибоассоциациимикроорганизмов(активныйил,искусственные консорциумы), способные окислять широкий спектрорганических соединений, однако БПК-биосенсоры наих основенедостаточно стабильны из-за изменения состава консорциума [2]; либоиндивидуальныекультурымикроорганизмовсопределеннымипотребительскими свойствами (стабильность при работе, способностьокислять различные классы органических веществ, устойчивость прииммобилизации и к воздействию негативных факторов окружающейсреды) [3].Ключевыммоментомвформированиистабильногобиочувствительного элемента БПК-биосенсора является иммобилизациямикроорганизмов, от которой зависит сама возможность измерениясигнала, операционные характеристики сенсора, чувствительность.
Методиммобилизации должен быть применим в достаточно широких диапазонах7температур, значений pH и осмотических давлений, обеспечиватьхорошую воспроизводимость при серийном производстве рецепторныхэлементов. Эффективные методы получения иммобилизованных клетоксвязаны с процессами включения их в природные и синтетическиегидрогели,протекающими,какправило,вмягкихусловияхиобеспечивающими высокий уровень диффузии субстратов и продуктов, атакже полную невозможность для клеток покинуть матрицу [4].
В качествесинтетическогогелеобразователя используют поливиниловыйспирт(ПВС). Однако применение ПВС в качестве основы рецепторного элементабиосенсорного анализатора малоэффективно, так как он образует тонкие,растворимые в воде пленки с низкой механической прочностью. НовымподходомприраспознающихиммобилизацииэлементовмикроорганизмовбиосенсоровявляетсядлясозданияиспользованиеN-винилпирролидона для модификации ПВС.
Получение механическипрочных пленок гидрогеля с иммобилизованными микроорганизмамиобеспечит технологическую возможность тиражирования расходныхбиочувствительных элементов для модификации кислородных электродовоксиметров амперометрического типа. Таким образом, для созданиябиосенсора для экспресс определения БПК необходимо произвести выборэффективного биокатализатора и способ его иммобилизации.Цель работыРазработка биотехнологических основ создания амперометрическогобиосенсорадлякислороданаэкспресс-определенияосновебиохимическогоиндивидуальнойкультурыипотребленияассоциациймикроорганизмов.Задачи работы1.Выбратьбиологическийматериалсоставляющийосновубиочувствительного элемента БПК-биосенсора, по способности дрожжейродов Ogataea, Candida, Debaryomyces, Arxula окислять широкий спектр8органических субстратов, по устойчивости при иммобилизации накислородном электроде и стабильности при работе.Разработать полимерную матрицу на основе поливинилового2.спирта,модифицированногоN-винилпирролидономдлясозданиянерастворимого сетчатого материала, подходящего для иммобилизациимикроорганизмов,чтообеспечиттехнологическиевозможноститиражирования расходных биочувствительных элементов.Составить устойчивые во времени искусственные ассоциации3.микроорганизмов, создать на их основе рецепторные элементы иопределитьхарактеристикиБПК-биосенсоров.характеристики биосенсоров на основеискусственныхиестественныхСравнитьосновныеиндивидуальнойкультуры,(активныйил)ассоциациймикроорганизмов иммобилизованных в гидрогель поливинилового спиртамодифицированного N-винилпирролидоном.4.Изучить влияние особенностей состава исследуемых проб (рH,соленость и присутствие соединений тяжелых металлов)анализа(температуры)наокислительнуюи условийспособностьдрожжей,иммобилизованных в модифицированный ПВС.5.Разработать методику определения БПК с использованиембиосенсорного анализатора.6.ПровестиапробациюБПК-биосенсоровнаобразцахприродных и сточнвх вод и сравнить результаты со стандартным методом.На основе полученных результатов совместно с ООО «Эконикс-Эксперт»разработать экспериментальный образец биосенсорного анализатора БПК.Научная новизнаПоказано, что иммобилизация микроорганизмов, происходящаянепосредственнополивиниловоговпроцессеспирта,формированиямодифицированногосетчатойструктурыN-винилпирролидоном,позволяет получать биочувствительные гидрогели для использования в9биотехнологии.
Методом ЯМР-спектроскопии установлена структураполивинилового спирта сшитого при участии N-винилпирролидона.Впервые проведено сравнение основных характеристик микробныхамперометрических биосенсоров на основе индивидуальной культуры,искусственныхиестественных(активныймикроорганизмов, иммобилизованных вил)ассоциацийгидрогель поливиниловогоспирта модифицированного N-винилпирролидоном.Впервые установлено, что дрожжи Debaryomyces hansenii ВКМ Y2482 способны к окислению широкого спектра органических веществ всильносоленых средах и при наличии ионов тяжелых металлов вконцентрациях, превышающих ПДК, что позволяет использовать их длясоздания биочувствительных элементов биосенсоров.Практическая значимостьИммобилизацияполивиниловогопозволяетцелыхспиртаполучатьклетокмикроорганизмовмодифицированногостабильныевгидрогельN-винилпирролидоном,биокатализаторы,которыеможноиспользовать для серийного изготовления биораспознающих элементовсенсоров.Сформированы биосенсоры кюветного типа для определениябиохимического потребления кислорода на основе индивидуальнойкультуры и ассоциаций микроорганизмов, характеризующиеся высокойчувствительностью и экспрессностью, и превосходящие мировые аналогипо данным характеристикам.
Работа вносит практический вклад вразработку быстрых методов анализа на основе биосенсоров и позволяет вперспективе производить недорогие и эффективные анализаторы воды.Совместно с малым инновационным предприятием ООО «Эконикс–Эксперт» изготовленэкспериментальный образец амперометрическогобиосенсорного анализатора для экспресс-определения БПК, в результатечего разработка подготовлена к промышленному выпуску.10Разработана и аттестована в Госстандарте методика определенияБПК с использованием биосенсорного анализатора.По результатам работы получено 2 патента: патент на полезнуюмодель № 117918 от 28.10.2011 «Устройство для определения степенизагрязнения воды биоразлогаемыми органическими веществами», патентна полезную модель № 164144 от 21.10.2015 «Устройство для экспрессанализа индекса биохимического потребления кислорода».Место проведения работыРабота выполнялась на кафедре химии Естественнонаучногоинститута ФГБОУ ВО Тульского государственного университета приподдержкеФЦП«Исследованияиразработкипоприоритетнымнаправлениям развития научно-технологического комплекса России на2014-2020 годы», соглашение № 14.574.21.0062 и государственногозадания в сфере научной деятельности Минобрнауки РФ (Задание№2014/227, проект № 1764).
Автор работы является победителем конкурсаПрограммы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса»,реализуемой Фондом содействия развитию малых форм предприятий внаучно-технической сфере в 2011 г. (№10022р/16818, г. Тула).Апробация работы и публикацииРезультаты работы докладывались на Московском международномконгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва,2011, 2013, 2015 гг.) (медали конкурса); Всероссийской конференции сэлементами научной школы для молодежи «Экотоксикология» (Тула, 2011(диплом победителя конкурса), 2012, 2013, 2014 (диплом победителяконкурса), 2016; I Конгрессе молодых ученых (Санкт-Петербург, 10-13апреля 2012 г); IX Всероссийской конференции по анализу объектовокружающей среды «Экоаналитика-2014» (Светлогорск, 22 – 28 июня 2014г. (диплом победителя конкурса)); Всероссийской научно-практической11конференции с международным участием «Биодиагностика состоянияприродных и природно-техногенных систем» (Киров, 2009, 2011, 2014 гг.);«Методы анализа и контроля качества воды» (Москва, 6 июня 2012 г.); IVмеждународной конференции «Биотехнология: наука и практика» (Ялта,20-24 сентября 2016г.).
По теме диссертации опубликовано 7 статей визданиях, рекомендованных ВАК, из них 2 статьи индексируемых в Web ofScience, 27 сообщений в тезисной форме и в виде материаловконференций.121. Литературный обзор1.1. Биохимическое потребление кислорода (БПК)Важнейшей характеристикой сточных и поверхностных вод являетсябиохимическое потребление кислорода (БПК)— количество растворенногокислорода (мг), необходимое для окисления всех биоразложимыхорганических отходов, находящихся в 1 дм3 воды [2]. БПК не включаетрасходование кислорода на нитрификацию.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
