Ядерные методы анализа

Лекция №10

Ядерные методы анализа

Ядерные (атомно-физические) методы лабораторного анализа отно­сятся к группе методов, позволяющих изучать тонкую структуру ком­понентных биопроб. Они основаны на взаимодействии с проникающи­ми излучениями, эффект от которого проявляется на молекулярном и атомарном уровнях.

Ядерные методы используют различные проявления взаимодей­ствия излучений с веществом, а также эффекты ядерных взаимодей­ствий:

— явление радиоактивности, т, е. способности атомных ядер са­мопроизвольно или искусственно распадаться;

— излучения корпускулярного или электромагнитного потоков, формируемых под действием ряда физических факторов;

— явление ионизации вещества, которое используется для регист­рации распределения ионных пакетов (пучков) в пространстве и во времени. При этом пакеты ионов формируются из молекул исследуе­мого вещества и разделяются в зависимости от отношения массы иона к его заряду;

— явления резонансов, наблюдаемые под действием переменных по частоте электромагнитных и магнитных полей. При этом регистри­руются характерные спектры, отражающие структуру и состав веще­ства или зависящие от концентрации компонентов;

Рекомендуемые материалы

— явление взаимодействия вещества с рентгеновским излучением, в результате которого регистрируются спектры рентгеновского излу­чения, отражающие состав исследуемых проб, или дифракционные картины, отражающие особенности структуры вещества;

— явление взаимодействия вещества с потоком электронов, лежа­щее в основе методов электронной микроскопии.

Основными видами излучений, используемых при ядерных мето­дах лабораторного анализа, являются корпускулярные излучения (аль­фа- и бета-частицы) и электромагнитные излучения (рентгеновское и гамма-излучение). Эти излучения возникают при радиоактивном рас­паде, причем имеет место как распад ядер по одному из видов распа­да, так и одновременно по нескольким видам. Ядерные процессы про­текают с выделением очень больших энергий. Если химические реак­ции требуют энергий порядка 10 эВ/атом, то ядерные реакции — ты­сячи и миллионы эВ/атом.

Скорость радиоактивного распада можно определить из выражения

                             (4.5)

где N — число распавшихся атомов; N₀ — число атомов до начала распада; — постоянная распада, характеризующая вероятность рас­пада на один атом в единицу времени t, определенная для любого эле­мента.

Другой величиной, характеризующей распад, является период по­лураспада ;  T_0,5 различных веществ колеблется от 10^-6 до 10¹⁰ лет. Внешние условия не сказываются на экспоненциаль­ном законе распада, что крайне важно в процессе измерений.

Различают три типа процесса взаимодействия вещества с излучением:

— фотоэлектрическое поглощение, сопровождающееся излу-чени­ем кванта рентгеновского излучения при переходе электрона с внеш­ней оболочки на внутреннюю за счет энергии фотоэффекта. Оно ха­рактерно для малых энергий и описывается уравнением:

,

где w — энергия связи электрона в атоме; — кинетическая энер­гия электрона.

При малых энергиях существенную роль начинает играть также релеевское рассеяние на связанных электронах атомов, и при определен­ных условиях может проявиться резонансное поглощение энергии внешних электрического и магнитного полей. Резонансные процессы поглощения и рассеяния оказываются существенными лишь в очень узких (резонансных) областях энергии, положение которых в энергети­ческом спектре индивидуально для различных элементов. Энергия рентгеновского характеристического излучения при этом невелика:

— комптон-эффект — упругое рассеяние кванта на свободном электроне — имеет место, когда энергия кванта значительно превыша­ет энергию связи электрона. Часть энергии кванта передается электро­ну, который может быть выброшен из атома, при этом направление движения кванта может измениться на некоторый угол , а электрон тоже отклоняется от направления движения кванта на угол , в общем случае не равный  Вероятность комптоновского рассеяния пропор­циональна количеству электронов в атоме, т. е. атомному номеру ве­щества;

— образование пар электрон-позитрон, которое начинает прояв­ляться при энергиях выше 1,022 , при этом избыточная энергия взаимодействующего кванта переходит в кинетическую энергию обра­зовавшейся пары. Для того чтобы при образовании пары сохранялись энергия   и   импульс,   процесс   должен   происходить   в   присутствии третьего тела — ядра или электрона, на котором рассеивается осталь­ная часть энергии кванта. Процесс поглощения квантов по принципу образования пар главным образом происходит у тяжелых элементов.

Одной из важных характеристик взаимодействия излучения с ве­ществом является проникающая способность, которая оценивается толщиной слоя двойного поглощения ,где  — коэффи­циент поглощения. Ослабление излучения, создаваемое слоем веще­ства толщиной h, характеризуется кратностью ослабления . Ве­личина ослабления зависит от угла падения излучения и уменьшает­ся, если поток квантов направлен под углом к поверхности облучае­мого объекта.

МЕТОДЫ, ОСНОВАННЫЕ НА ЯВЛЕНИИ

РАДИОАКТИВНОСТИ

Методы анализа, основанные на явлении и эффектах радиоактив­ности, используют вещества-радиоизотопы, способные спонтанно или вынужденно распадаться с получением из ядра корпускулярного или электромагнитного излучения. Число радиоизотопов в настоящее вре­мя превышает 1100.

Сущность использования изотопов заключается во введении их в исследуемую систему и контроле перемещения или концентрирования в процессе функционирования данной системы. По распределению ра­диоизотопов в образце можно выявлять области с большей или мень­шей относительной концентрацией интересующих исследователя со­единений, определять размеры этих областей, изучать особенности протекания реакций/Введение активных изотопов в соединения и ре­гистрация их, а также вторичных излучений позволяют получать ин­формацию о составе и структуре исследуемых сред. Радиоизотопный метод приобрел большое значение для медико-биологических лабора­торий, где с его помощью уже можно определить более 50 различных биологических соединений. Основным преимуществом радиоизотопно­го метода по сравнению с другими является возможность изучения равновесных биологических процессов без нарушения их химического равновесия.

Все медико-диагностические радиоизотопные методики исследова­ния можно разделить на две группы:

—   in vivo — осуществляются на целом организме человека;

— in vitro — проводятся в предварительно отобранной из организ­ма пробе.

Все исследования биопроб можно также разделить на два типа в зависимости от способа введения радиоактивного (РА) препарата: в первом случае РА-вещество предварительно вводится в организм, по­сле чего уровень радиоактивности  через определенное время измеряет­ся в отобранной пробе (например, в крови); во втором — РА-препарат в организм вообще не вводится, а служит маркером для выявления конкретного компонента пробы (например, радиоиммунологический).

При выборе типа радиоизотопа должны выполняться некоторые специфические требования:

— учет характерности соединения для изучаемых процессов, кото­рая выражается тропностью — отношением концентрации вводимого вещества к естественной концентрации этого вещества в исследуемой биопробе;

— минимальная токсичность соединений для исследователей, что определяет концентрацию используемых радиоизотопов;

— обязательный контроль процессов взаимодействия вводимого радиоизотопного индикатора с компонентами соединений;

— учет естественной убыли активности изотопа при анализе ре­зультатов (определяется временем полураспада Т_0,5).

Для регистрации активности радиоизотопов используются методы спектроскопии ионизирующих соединений.

Одним из вариантов радиоизотопного метода является авторадио­графия ,в основе которой лежит фотохимический процесс. Ве­щество биопробы, содержащее предварительно введенные радиоизото­пы, приводится в соприкосновение с фотоэмульсией на пленке. Интен­сивность почернения эмульсии пропорциональна концентрации иссле­дуемого компонента. Количественные измерения проводят на денсито­метрах после проявления пленки.

При исследованиях жидких проб их необходимо предварительно подготовить. С этой целью пробу наносят на подложку (чаще всего стеклянную). Затем препарат окрашивают красителями, содержащими радиоактивные изотопы. Эти вещества концентрируются на отдельных участках в соответствии с зонами исследуемого вещества.

Основной характеристикой метода является разрешающая способ­ность, которая определяется как линейное расстояние между двумя то­чечными источниками излучения, различаемыми как отдельные на проявленной пленке. На достоверность авторадиограммы влияют каче­ство фотоэмульсии, расстояние от поверхности образца до пленки, а также вид излучения. Альфа-излучение вызывает сильную ионизацию эмульсии, но оно токсично; а бета-излучение дает расплывчатое изо­бражение. Широкое распространение получило гамма-излучение, хотя оно имеет более низкую ионизирующую способность.

Метод гамма-резонансной спектроскопии (ГРСС) основан на изучении зависимости числа гамма-квантов, прошедших через образец (т. е. интенсивности поглощенного гамма-излучения), от частоты из­лучения гамма-квантов РА-изотопом.

Метод позволяет получить необходимые сведения о строении мо­лекул. Разная частота излучения создается изменением скорости пере­мещения источника гамма-излучения относительно образца (эффект Доплера). При определенной частоте гамма-излучения ядра атомов, поглощая гамма-кванты, переходят из нормального состояния в возбу­жденное. В спектре этому эффекту соответствует минимум пропуска­ния (рис. 4.12.).                                                                              

Эффект Мессбауэра, на котором основана гамма-спектроскопия, заключается в том, что относительная энергия основного и возбуж­денного состояний ядра атома зависит от электронной плотности около него. Поэтому метод оказывается чувствительным при изуче­нии строения электронных оболочек атомов в различных химических соединениях.

Как уже отмечалось, при исследовании структуры и свойств моле­кул, взаимодействия молекул в растворах, процессов ассоциации моле­кул находит применение флуоресцентный анализ. Одной из разновид­ностью   этого   метода   является   рентгенофлуоресцентный   анализ.Такие характеристики, как спектр излучения и длительность, не зависят от вида возбуждения. Флуоресценция с помощью радиоак­тивных веществ подкупает простотой своей технической реализации, поэтому она нашла применение при исследовании многих жидких био­проб и структуры биологических микрообъектов.

Рис. 4.12. Типичный спектр для гамма-резонансной спектроскопии

 Весьма чувствительным (нанограммы вещества и менее на 1 мл пробы) и специфичным методом исследования некоторых биологиче­ских веществ (в частности, антигенов и антител) в жидких пробах яв­ляется радиоиммунологический анализ , технологическая процедура которого подробно рассмотрена ранее. Принцип РИА со­стоит в применении радиоактивного изотопа, который действует как маркер исследуемого вещества. Оценка результата производится коли­чественно с помощью различных счетчиков радиоактивности.

Принципиальным для радиоиммунологического исследования явля­ется введение в анализируемую смесь специфического реагента в оп­ределенной концентрации. В зависимости от этого реагента различают несколько модификаций метода. Так при введении специфических свя­зывающих белков проводится конкурентный белковосвязный анализ  ;при введении специфических энзимов—радиоэнзимный анализ : при введении специфических микроорганизмов—ра­диомикробиологический анализ  и т.п.

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Метод масс-спектрометрии (МСМ) основан на ионизации атомов и молекул изучаемого вещества и последующем разделении образовав­шихся ионов в магнитном и электрическом полях. Определение содер­жания в смесях различных по химическому и изотопному составу со­единений и их молекулярный или атомный вес производится на основе регистрации ионных пучков (пакетов), полученных при ионизации и последующем разделении вещества.

Для ионизации пробу облучают фотонами, ионами, воздействуют на нее электрическим полем и др. В ходе дальнейшего эксперимента происходит пространственное разделение пучков ионов с разными от­ношениями массового числа иона m к его заряду q (масс-спектр) (под массовым числом понимается сумма протонов и нейтронов ядра). В основе разделения лежит свойство ионов менять направление или ско­рость своего движения в электрическом и (или) магнитном полях в за­висимости от масс-спектра частицы.

При проведении исследования последовательно выполняют сле­дующие операции:

— перевод образцов твердых или жидких сред в газообразное со­стояние;

— ионизация молекул анализируемого вещества и форми-рование ионного пучка;

— разделение ионного пучка по массам в магнитном и (или) элек­трическом полях;

— улавливание ионов;

— раздельное измерение и регистрация ионных токов каждой со­ставляющей ионного пучка.

Принцип разделения ионов можно пояснить следующим образом (рис. 9.2). Пусть ионы вещества, вылетая из узкой щели, двигаются в однородном поперечном магнитном поле с напряженностью Н. Щель, расположенная в точке S, выделяет ионы в пределах угла 2α, и ионы будут двигаться по окружности с радиусом Центральный луч пересечет ось  в точке х₀ = 2r, а лучи, прошедшие у края щели, пересекут ось  в , при этом ширина изображения.Если угол мал, то

,

где ν_ начальная скорость вылета иона;  определяется па­раметрами масс-спектрометра.

Рис. 4.13. Принцип разделения ионов в масс-спектрометрии

Таким образом, ионы с разными масс-спектрами (m/q) будут сфо­кусированы в разных точках оси. Меняя напряженность магнитного поля, можно последовательно фокусировать в одну точку ионы с раз­ными отношениями (m/q) и построить масс-спектрограмму N=f(m) (рис. 4.14.). Аналогичная картина возникает при использовании электри­ческого поля. Неискаженное движение ионов возможно только в высо­ком вакууме (давлении не свыше 10^-7 ртутного столба).

В масс-спектрометрии возможно использование:

— постоянных или медленно изменяющихся во времени полей;

— полей, период изменения которых соизмерим со временем дви­жения ионов;

— комбинации последовательно расположенных электрических и магнитных полей.

Использование статических электрических полей позволяет разде­лить ионы только по энергиям, в статических магнитных полях они разделяются по массам. Возможна комбинация последовательно распо­ложенных электрических и магнитных полей, определенный подбор которых позволяет значительно улучшить разделительные свойства метода. С применением переменного электрического поля возникает возможность разделения ионов в зависимости от их энергии и во вре­мя движения. При этом различать ионы по энергии позволяет постоян­ное магнитное поле, которое используется в сочетании с переменным электрическим. Переменное магнитное поле не нашло применение в масс-спектрометрии

Для получения информации об исследуемом веществе необходимо зарегистрировать соответствующий ему массовый спектр, который образуется при пространственном распределении ионов.

Рис. 4.14. Типичная масс-спектрограмма сложного соединения

Основными па­раметрами спектра являются высота (или интенсивность) пиков, зави­сящая от количества ионов данной массы, которые поступают на де­тектор, и значение массы ионов, соответствующее каждому пику. По относительной интенсивности каждого выделенного пучка определяют концентрации компонентов анализируемой смеси, а по масс-спектрам — точные формулы молекул и молекулярные массы. При опреде­лении массы различных ионов необходимо чтобы пики, соответствую­щие этим ионам, были четко разделены.

Лекция № 11

МЕТОДЫ, ОСНОВАННЫЕ НА ЯВЛЕНИЯХ РЕЗОНАНСОВ

Резонансные методы основаны на квантовомеханических эффек­тах, которые заключаются в том, что магнитные диполи (которыми являются молекулы исследуемого образца) ориентируются во внеш­нем магнитном поле таким образом, чтобы проекции магнитных мо­ментов направления поля могли принимать дискретный ряд значе­ний. Каждое дискретное значение соответствует определенной энер­гии взаимодействия диполя с внешним магнитным полем. При ком­натной температуре в объекте реализуются все разрешенные ориента­ции магнитного момента. Если же к молекуле подвести порцию энер­гии, в точности равную разности энергий молекулы в состояниях с различной величиной проекции магнитного момента, то этот квант энергии будет поглощен.

Энергия кванта определяется его частотой, поэтому имеет место поглощение энергии при строго определенной частоте. Явления резонансов, выражающиеся в интенсивном поглощении или излучении энергии веществом при возбуждении его переменными электрическим, магнитным или электромагнитным полями, порождают целый ряд тон­ких и высокоточных радиоспектрометрических методов изучения свойств компонентов пробы.

К радиоспектроскопическим методам анализа, изучающим взаимо­действие вещества с излучением в радиочастотном диапазоне, относят­ся спектроскопия ЯМР и ЭПР. Оба метода основаны на явлении маг­нитного резонанса — избирательном поглощении электромагнитного излучения в радиочастотном диапазоне и обусловлены магнитными свойствами частиц (электронов и ядер).

Различают несколько видов магнитного резонанса в атомах и дру­гих субмикрочастицах.

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) — резонансное поглоще­ние электромагнитной энергии в веществах,  обусловленное магнетизмом ядер. Метод анализа, основанный на ЯМР, можно использо­вать для изучения всех ядер, которые обладают собственным момен­том количества движения (спином) и связанным с ним магнитным моментом.

Резонанс наблюдается в сильном постоянном магнитном поле, на которое для получения эффекта резонансного поглощения накладыва­ют более слабое радиочастотное магнитное поле. В магнитном поле для спина ядра могут реализоваться две ориентации: вдоль и против направления силовых линий внешнего поля. Каждому значению спина соответствует определенное значение энергии. Переориентация спина ядра из состояния с меньшей энергией (направление против поля) в состояние с большей энергией (направление вдоль поля), что, собст­венно, и происходит при наложении радиочастотного магнитного поля с определенной частотой, сопровождается поглощением энергии (т. е. наблюдается явление магнитного резонанса).

Поглощение энергии происходит при переориентации спина ядра из состояния с меньшей энергией (направление против поля) в состояние с большей энергией (направление вдоль поля), что и происходит при наложении радиочастотного магнитного поля.

Такое поглощение энер­гии может быть обнаружено по наведенной ЭДС в катушке индуктив­ности, окружающей исследуемую пробу. Процесс исследования сво­дится к снятию спектра ЯМР и его расшифровке. По спектру ядерного магнитного резонанса можно определить свойства ядер, строение мо­лекул, подвижность частиц в различных условиях.

Чрезвычайно широко метод ЯМР применяется при исследовании протонного резонанса в атомах водорода — ядерный протонный ре­зонанс (ЯПР). Рассмотрение спектра протонного резонанса неизвест­ного органического соединения дает сведения о том, в какие его ради­калы (группы) входит водород и, следовательно, каково строение этого вещества.

О природе химических связей в веществе позволяет судить ядер­ный квадрупольный резонанс (ЯКР), наблюдаемый при введении ядра в неоднородное электрическое поле. Квадрупольный момент ха­рактеризует отклонение распределения электрического заряда ядра от сферической симметрии, поэтому при неоднородности электриче­ского поля у ядер атомов или ионов на спектре ЯКР появляется ха­рактерный сигнал.

Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) — резонансное поглощение энергии радиочастотного поля в веществах, содержащих парамагнитные частицы, при наложении постоянного магнитного по­ля. В основе ЭПР, как и ЯМР, лежит принцип магнитного резонанса, однако ЭПР-сигналы при одном и том же значении напряженности по­стоянного магнитного поля расположены в области более высоких час­тот (микроволновая область).

ЭПР представляет собой совокупность явлений, связанных с кван­товыми переходами между энергетическими уровнями атомов или молекул под влиянием переменного магнитного поля резонансной частоты. Метод ЭПР позволяет определить положение энергетиче­ских уровней парамагнитных частиц (атомов, ионов, радикалов и мо­лекул, имеющих неспаренные электроны). Частота, при которой про­исходит резонанс, пропорциональна напряженности внешнего маг­нитного поля, поэтому спектр ЭПР покушает зависимость интен­сивности поглощения исследуемым веществом энергии радиочастот­ного поля заданной частоты от величины напряженности постоянно­го магнитного поля. Появление или отсутствие спектра ЭПР в пробе дает полезную информацию о строении вещества, радикальном или ионно-радикальном механизме реакции, особенностях электронной структуры тяжелых атомов.

При помощи метода ЭПР удается провести количественные изуче­ния диффузии свободных радикалов, исследовать ферментативные процессы, сопровождающиеся превращениями свободных радикалов. При исследовании жидких биопроб ЭПР наблюдается также в раство­рах, содержащих ионы VO²⁺, Cr³⁺, Mn²⁺, Fe³⁺, Cu²⁺ и некоторые другие. В качестве растворителей могут выступать вода, спирты, глицерин, ацетон и т. п.

При воздействии на вещество переменными электромагнитными полями двух различных частот имеет место двойной резонанс, нашед­ший применение при исследовании оптически возбужденных веществ. Возможны также и другие типы резонансов.

 МЕТОДЫ РЕНТГЕНОВСКОЙ СПЕКТРОСКОПИИ

Возможности изучения состава и структуры сложных веществ по характеристическим рентгеновским спектрам непосредственно следу­ют из закона Мозли, утверждающего, что квадратный корень из численных значений термов для линий спектров испускания или для ос­новного края поглощения является линейной функцией атомного но­мера элемента или заряда ядра. Терм — числовой параметр, характе­ризующий частоту спектров поглощения. Линии характеристического рентгеновского спектра немногочисленны. Для каждого элемента их число вполне определенное и индивидуальное.

Достоинством анализа рентгеновского спектра [метод рентгенов­ской спектрометрии  является то, что относительная интен­сивность большинства спектральных линий постоянна, и основные параметры излучения не зависят от химического состава соединений и смесей, в которые входит данный элемент. В то же время количест­во линий в спектре может зависеть от концентрации данного элемен­та: при очень малых концентрациях элемента в спектре соединения появляются только две-три ярко выраженные линии. Для анализа со­единений по спектрам необходимо определить длины волн основных линий (качественный анализ) и их относительную интенсивность (ко­личественный анализ). Длины волн рентгеновских лучей имеют тот же порядок, что и межатомные расстояния в кристаллических решет­ках исследуемых веществ. Поэтому, регистрируя спектр отраженного излучения, можно получить представление о составе исследуемого соединения.

Известны разновидности метода , в которых используются вторичные эффекты, сопровождающие процесс взаимодействия рентге­новского излучения с веществом биопробы. К данной группе методов в первую очередь относятся эмиссионная рентгеноспектрометрия , при которой регистрируется рентгеновский спектр, возбуж­денный электронами, и абсорбционная рентгеноспектрометрия , по механизму взаимодействия излучения с веществом анало­гичная методу абсорбционной спектрофотометрии.

Чувствительность методов  очень сильно меняется (от 10^-4 до 5,10^-10 %) в зависимости от выхода характеристического излучения, контрастности линий, метода возбуждения, методов регистрации и раз­ложения излучения в спектр. Количественный анализ данных  можно проводить по спектрам излучения (первичным и вторичным) и спектрам поглощения. Невозможность строгого учета взаимодействия излучения с атомами вещества, а также влияния всех условий проведе­ния измерения заставляют ограничиваться измерениями относительной интенсивности излучений и использовать методы внутреннего или внешнего стандарта.

При исследовании структуры и свойств молекул, процессов ассо­циации молекул и взаимодействия их в растворах широко применяется рентгенофлуоресцентная спектрометрия , о которой уже говорилось выше.

Длины волн рентгеновских лучей имеют тот же порядок, что и межатомные расстояния в кристаллических решетках исследуемых ве­ществ. Поэтому при взаимодействии рентгеновского излучения с про­бой возникает характерная дифракционная картина, отражающая осо­бенности структуры кристаллических решеток или дисперсных систем, т. е. характеризующая состав исследуемого соединения. Исследование структуры соединений и их отдельных компонентов по дифракцион­ным картинам рассеяния рентгеновского излучения на кристаллических решетках и неоднородностях структур положено в основу рентгеноструктурного анализа . Регистрация спектра может осу­ществляться с помощью фотографической пленки (качественный ана­лиз) либо ионизационных, сцинтилляционных или полупроводниковых детекторов. Данный метод позволяет определять симметрию кристал­лов, величины, форму и типы элементарных ячеек, проводить количе­ственные исследования гетерогенных растворов.

 МЕТОДЫ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ

Значительное увеличение разрешающей способности в микроскопе можно получить при использовании пучков быстролетящих в вакууме электронов. Эффект взаимодействия электронных пучков с веществом используется в электронных микроскопах. Принципиально разрешение электронного микроскопа могло бы превосходить разрешение светово­го микроскопа в сотни тысяч раз, так как эквивалентная длина волны для электрона

,                            (4.6)

где h — постоянная Планка; U— ускоряющая разность потенциалов.

Однако разрешение определяется не только явлениями дифракции, но и различными аберрациями электронных линз, используемых для фокусировки электронных пучков. Эти аберрации полностью некоррелируемы, хотя и несколько исправляются главным образом диафрагми­рованием и применением электронных пучков малых апертур. Поэто­му разрешение современных электронных микроскопов не превышает 0,45—0,5 мкм и всего в несколько сот раз выше разрешения лучшего светового (ультрафиолетового) микроскопа (200—250 мкм).

Ещё посмотрите лекцию "6 Интеграл от функции комплексной переменной" по этой теме.

Окончательное изображение в микроскопе формируется на флуо­ресцирующем экране или фотопластинке. Контраст изображения опре­деляется долями электронов, рассеянных на микроучастке и прошед­ших через апертуру. Для управления электронными пучками использу­ются центрированные максимально симметричные электрические и маг­нитные поля, т. е. электронные линзы электростатического или маг­нитного типов. При получении изображений достаточной яркости не­посредственно в электронном микроскопе с увеличением в несколько сот тысяч раз плотность тока на объекте должна достигать нескольких ампер на квадратный сантиметр. Чтобы уменьшить нагрев образца, приходится сильно уменьшать облучаемую область (до нескольких квадратных микрометров). Важным достоинством электронного микроскопа является большая глубина резкости, превосходящая почти на три порядка глубину резкости оптического микроскопа.

Метод эмиссионной электронной микроскопии  по­зволяет получить изображение объекта в электронах, которые эмити­рует сам объект. Эмиссия может быть результатом нагрева (термо­электронная эмиссия), освещения (фотоэлектронная эмиссия), бом­бардировки электронами или ионами (вторичная электронная или ионно-электронная эмиссия), действия сильных электрических полей (автоэлектронная эмиссия). Разрешение эмиссионных микроскопов значительно хуже просвечивающих ив зависимости от типа эмиссии достигает 20—100 мкм.

В методе отражательной электронной микроскопии () изображение формируется в отраженных образцом электронах. Распре­деление отраженных электронов существенно зависит от углов облуче­ния и наблюдения, а также от материала образца. Разрешение такого микроскопа не выше 25—30 мкм.

В методе растровой электронной микроскопии (РЭМС) обра­зец сканируется тонким электронным пучком, обегающим за время развертки всю исследуемую поверхность. В каждой точке соприкос­новения электронного луча с веществом возникает ряд излучений: вторичные и рассеянные электроны, рентгеновские лучи, световое излучение и т. д., которые используются для получения изображе­ний на экранах электронно-лучевых трубок. Разрешение растровых микроскопов определяется диаметром пучка и видом используемого излучения.

Теневое изображение объекта получается с помощью метода тене­вой электронной микроскопии (ТЭМС), при котором тонкий элек­тронный пучок, облучающий образец, остается неподвижным. Разре­шение теневого микроскопа определяется диаметром пучка и характе­ром дифракционных явлений. На образование изображения влияют различия в рассеянии и поглощении электронов разными участками образца. Яркость изображения получается значительно ниже, чем при использовании метода просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМС), и для ее увеличения возможно применение способов повы­шения контраста, например, с помощью электронно-оптических преоб­разователей.

 Непосредственное исследование жидких проб в электронных мик­роскопах невозможно, поэтому обязательной является предварительная их подготовка: обезвоживание, высушивание и заключение в некото­рую формирующую среду, которая исключает появление артефактов, способных исказить результаты исследований.