Лаборатории на кристалле
3.5. Лаборатории-на-кристалле
Под термином «лаборатория-на-кристалле» понимается миниатюрное устройство, предназначенное для проведения различных химических и физических процессов со сверхмалыми объемами и количествами веществ неорганической и органической природы, находящихся в жидком или газообразном состоянии, с высокой степенью локализации воздействия.
Типичные размеры элементов лабораторий составляют от нескольких микрометров до нескольких миллиметров, а типичная скорость перекачки жидкости - от нескольких микролитров до десятков миллилитров в минуту.
Основное применение данные микросистемы находят в медицине (химический анализ жидкостей, крови, ДНК; системы дозирования и ввода различных лекарственных препаратов).
Лаборатории-на-кристалле по сравнению с традиционными системами анализа имеют следующие преимущества:
- малое время отклика. Микролаборатория с высокой скоростью позволяет доставлять малые объемы анализируемого вещества в область реакции, изменять его физические и химические характеристики (нагревать/охлаждать, смешивать с другими веществами) и далее доставлять продукты реакции в область анализатора;
-низкие потери. Интегральное исполнение лабораторий позволяет снизить потери в потоках реагентов и продуктов реакции. Это является важной характеристикой этих устройств при работе с опасными или дорогими реагентами, а также при дозировке лекарственных препаратов;
- высокое значение отношения площади поверхности к объему жидкости. Данное свойство позволяет эффективно смешивать жидкие реагенты или обеспечивать большую площадь реакции с реагентом в твердом состоянии, а также улучшать теплопередачу для нагревания или охлаждения анализируемых веществ и обеспечивать возможность эффективного контроля температурного режима реакций.
Состав каждой лаборатории-на-кристалле определяется ее назначением.
Рекомендуемые материалы
При изготовлении лабораторий в основном нашли применения LIGA-тех-нология, технология объемной микрообработки кремния, жидкостное химическое травление стекла и сухие пленочные фоторезисторы. Данные технологии позволяют снизить стоимость различных подсистем и изготавливать одноразовые подсистемы лабораторий, предназначенные для работы с образцами при диагностике опасных заболеваний (СПИД, гепатит и т.д.).
Также важной особенностью при изготовлении лабораторий-на-кристал-ле является выбор подложки, которая должна удовлетворять следующим требованиям:
- химическая инертность по отношению к анализируемым веществам, реагентам и продуктам реакции;
- возможность реализации в подложке канала с микронными размерами;
- высокие диэлектрические свойства.
Несмотря на преимущества лабораторий-на-кристалле перед традиционными системами анализа веществ, при проектировании данных микросистем также возникают некоторые проблемы. Уменьшение размеров подсистем лабораторий приводит к возникновению трудностей при моделировании как механических, так физических и химических процессов, происходящих в микросистеме.
3.5.1. Газовый хроматограф
В начале 80-х годов в Стэндфордском университете (США) был разработан первый прототип интегральной лаборатории-на-кристалле, названный газовым хроматографом.
Газовый хроматограф позволяет установить наличие тех или иных веществ в газовой пробе. Математическая обработка сигнала хроматографа позволяет определить не только факт наличия веществ, но и процентный состав анализируемой смеси.
Основная идея газовой хроматографии состоит в следующем. Смесь газов пропускают через транспортную систему, имеющую поверхность с известными характеристиками. Когда газовая проба вместе с газом-носителем движется через транспортную систему, взаимодействие молекул газа со стенками приводит к возрастанию отличий в подвижности между компонентами газовой смеси. Из-за различной подвижности разные компоненты смеси достигают конца системы за разное время, что позволяет идентифицировать составляющие фракции. Момент прихода того или иного компонента газа к концу колонки фиксируется терморезистором.
Блок-схема газового хроматографа показана на рис.3.4. Устройство размещено на кремниевой подложке и занимает площадь 4 мм2.
Рис.3.4. Структура газового хроматографа: 1 - вход вентиля газовой пробы; 2 - вход вентиля газа носителя; 3 - входной вентиль; 4 - выходной вентиль; 5 - терморезисторы; 6 - транспортная система
Все составляющие хроматографа выполнены с применением методов фотолитографии, химического травления и электростатического соединения.
Эффективность работы любого хроматографа пропорциональна отношению длины транспортной системы и коэффициента диффузии изучаемого компонента газовой смеси. Поэтому при конструировании хроматографов стремятся увеличить длину транспортной системы.
В рассматриваемом хроматографе транспортная система представляет собой капилляр в виде спиральной канавки шириной 200 мкм, глубиной 40 мкм и длиной 1,5 м, полученной изотропным травлением кремниевой подложки. После того как кремниевая подложка электростатически соединяется со стеклянной пластиной, спиральная канавка превращается в капиллярную газовую разделительную систему, спиральные участки которой герметически изолированы благодаря прочному соединению кремния со стеклом.
Газ в колонку поступает через вентиль, выполненный в кремниевой подложке. Тело вентиля создается в три этапа. Сначала с помощью изотропного травления делают углубление, образующее цилиндр вентиля. Вторым изотропным травлением формируют углубление, где располагается диафрагма вентиля. На заключительном этапе с помощью анизотропного травления в пластине формируют маленькие отверстия входа и выхода вентиля. В качестве гибкой герметизирующей диафрагмы вентиля используют тонкий (5... 15 мкм) никелевый диск, изгибаемый с помощью небольшого соленоида.
Поверхность герметизирующей диафрагмы и тело вентиля покрыты органической пленкой парилена, предохраняющей от утечек газа.
Терморезистор изготавливается методами микроэлектронной технологии на отдельной подложке кремния. На первом этапе исходная подложка окисляется с двух сторон, так что на обеих ее сторонах создается защитная маска из SiCb. На одной стороне с помощью фотолитографии формируется терморезистор толщиной 1000 А0. На обратной стороне подложки вскрывают окно в защитном слое SiCb и с помощью технологии объемной микрообработки удаляют весь кремний до стоп-слоя из двуокиси кремния на передней стороне кремниевой подложки. Таким образом, терморезистор оказывается термически изолирован от кремниевой подложки. Газы, разделяемые в капиллярной системе, проходят над терморезистором, а затем выпускаются. Благодаря хорошей термической изоляции терморезистора от остальной конструкции хроматографа его сопротивление при заданном расходе протекающего газа зависит от теплопроводности окружающей газовой среды. Изменение теплопроводности приводит к изменению локальной температуры терморезистора и, следовательно, его сопротивления. Предварительная градуировка терморезистора позволяет по изменению его сопротивления установить наличие того или иного компонента газовой смеси. Этому способствует высокий температурный коэффициент сопротивления никеля - около 0,55 % град0.
Газовый хроматограф работает следующим образом. После полной продувки системы инертным газом-носителем, который поступает на вход 2 под избыточным давлением 0,2 атм., вентиль 3 открывается и через вход 1 в капиллярную систему поступает проба неизвестного газа под давлением несколько выше, чем 0,2 атм. После введения пробы объемом около 5 нанолитров вентиль снова закрывается и газ-носитель переносит пробу через транспортную систему 6. Поскольку вытравленный капилляр имеет наполнитель для газовой хроматографии, входящие в состав пробы компоненты разного молекулярного веса проходят через систему с разной скоростью и поэтому выходят из системы последовательно. Терморезистор 5 воспринимает колебания теплопроводности газового потока, и изменение его сопротивления приводит к изменению падения напряжения на нем. Типичный вид сигнала с газового хроматографа показан на рис. 3.5.
Рис.3.5. Выходной сигнал газового хроматографа: А - азот; В - пентан; С - дихлорметан; D - дихроформ; Е - 111-трихлорэтан; F - трихлорэтилен; G – толуол
В состав хроматографа входит несколько вентилей и вспомогательных газовых каналов, обеспечивающих предварительную подготовку прибора к работе, например, блок продувки, канал выброса неиспользованной пробы, автоматический измеритель интервалов времени.
В настоящее время имеются сообщения о разработке вариантов газового хроматографа, способного определить наличие в пробе газа восьми составляющих в течение трех минут с абсолютной погрешностью до 10-5.
3.5.2. Жидкостный хроматограф
Жидкостный хроматограф включает в себя не только систему разделения, но и систему количественного измерения содержания каждого компонента, т.е. систему детектирования (вместе с системой обработки хроматографического сигнала).
Для обеспечения анализа многокомпонентных смесей с высокой чувствительностью жидкостный хроматограф должен иметь в своем составе ряд блоков.
Схема жидкостного хроматографа приведена на рис. 3.6.
Рис 3.6. Структура жидкостного хроматографа
В состав любого хроматографа входят пять обязательных составных частей: насос для подачи подвижной фазы через колонку (1), дозатор для введения пробы в колонку (2), разделительная колонка - сердце хроматографа (3), детектор - устройство для получения аналитического сигнала, пропорционального концентрации компонента (4), система обработки - преобразователь аналитического сигнала в форму, удобную для восприятия системой автоматического управления (5).
В состав хроматографа для удобства работы и расширения его аналитических возможностей могут входить ряд дополнительных устройств.
1) Устройство подготовки подвижной фазы.
Функции - фильтрование и дегазация растворителей. Фильтрование - методом пропускания растворителя через фильтр 0,2-0,5 мкм перед заливкой его в емкость или методом установки на входе насоса фильтра с небольшим сопротивлением. Дегазация - вакуумом или нагреванием, или пропусканием через растворитель инертного газа, например, гелия.
2) Термостат колонок.
Адсорбция в жидкостных и газовых хроматографах - процесс термодинамический, зависит от температуры. Следовательно, величина удерживания зависит от температуры. Кроме того, от температуры зависит вязкость растворителя, что определяет эффективность колонки. Таким образом, все три основные характеристики колонки: селективность, емкость и эффективность зависят от температуры. Для стабилизации условий разделения, чтобы получить воспроизводимые времена удерживания, амплитуды пиков и хорошее разделение, необходимо термостатирование колонок. Обычно температура термостата 30-50 °С, стабильность поддержания температуры - 0,3-0,5°С. Многие жидкостные хроматографы не имеют термостатов, так как колебания температуры в комнате не очень велики и воспроизводимость показаний приемлемая.
3) Послеколоночный реактор.
В ряде случаев трудно найти подходящий способ прямого детектирования выходящих из колонки компонентов (анализ аминокислот, определение тяжелых металлов и т.д.). В этом случае после колонки ставится реактор, где смешивается реагент и разделенные вещества (например, металлы). При этом получают интенсивно окрашенное соединение, которое можно детектировать на фотометре.
4) Автоматический дозатор (автосамплер).
Автоматический дозатор необходим в случае многократного повторения анализа больших серий однотипных образцов. При этом используется один расход растворителя, одна колонка. После окончания анализа (выхода последнего пика) производится автоматический ввод следующей пробы. Сами пробы предварительно заливаются в ампулы, которые устанавливаются на специальном столике. Специальный насос засасывает из ампулы пробу, прокачивает ее через пробоотборную петлю дозатора. При повороте дозатора петля промывается элюентом и проба попадает в колонку.
5) Градиентное устройство.
В ряде случаев при разделении сложных смесей необходимо в процессе разделения изменять состав растворителя по определенному закону для ускорения анализа и улучшения разделения. Эту роль выполняет градиентное устройство.
Все основные узлы жидкостного хроматографа связаны между собой транспортными системами (насос - дозатор - детектор). Для этих целей обычно используются капилляры из нержавеющей стали внутренним диаметром 0,2-0,3 мм, наружным диаметром 1,0-1,6 мм. Эти капилляры могут выдерживать давление до 1000 атм., достаточно гибки и не поддаются коррозии. Однако в ионообменной и ионной хроматографии коррозионная стойкость нержавеющей стали мала, происходит реакция железа, марганца, никеля, кобальта с реагентами, что вносит существенные помехи при определении этих металлов в пробе. В этом случае капилляры выполняются из титан-циркониевых сплавов.
В последнее время за рубежом получили распространение капилляры из полиэтерэтеркетона, обладающих высокой коррозионной стойкостью и большой механической прочностью (держат давление до 300-400 кгс/см2). Однако их стоимость в 4-5 раза выше, чем у титановых капилляров. Применение фторопластовых капилляров себя не оправдало из-за их малой механической прочности.
Сорбенты, используемые в жидкостных хроматографах, характеризуются высокой скоростью массопередачи, что достигается, главным образом, уменьшением размера частиц сорбента. Это позволяет работать при высоких линейных скоростях потока подвижной фазы, что резко сокращает время анализа. Но при малых размерах частиц сорбента высокая скорость потока через колонку может быть реализована в случае, если растворитель подается в колонку под высоким давлением (до 150-250 атм.).
Для обеспечения высокой скорости разделения колонки в данных устройствах имеют небольшой размер. Но чем меньше колонка, тем меньше, для исключения перегрузок, должен быть объем вводимой пробы (не более 1% от объема колонки). При этом уменьшается и объем растворителя, соответствующего хроматографическому пику. Для исключения расширения пика в детекторе объем детектора должен быть не более 10% от объема минимального пика (не более 10 мкл). Так как пробы вводится в дозатор очень мало, то детектор в хроматографе должен иметь высокую чувствительность.
В табл.3.6 представлены характеристики хроматографической колонки.
Таблица 3.6 - Характеристики жидкостного хроматографа
| Параметр | Значение |
| Размер частиц сорбента, мкм | 5-7.5 |
| Длина колонки, см | 15-25 |
| Внутренний диаметр, мм | 4,6 |
| Расход подвижной фазы, мл/мин | 1-2 |
| Линейная скорость подвижной фазы, см/мин | 15 |
| Рабочее давление на входе в колонку, атм | 50-200 |
| Продолжительность цикла разделения, мин | 10 |
3.5.3. Детектирующие устройства микролабораторий
Детектор является преобразователем концентрации анализируемого вещества, растворенного в подвижной фазе, в электрический сигнал.
В первых хроматографах прошедшая через колонку подвижная фаза с компонентами пробы просто собиралась в небольшие сосуды, а затем методами титриметрии, колориметрии, полярографии и т.д. определялось содержание компонента в этой порции. Т.е. процессы разделения пробы и определения ее количественного состава были разделены во времени и пространстве. В современном хроматографе эти процессы объединены в одном приборе.
Для детектирования компонентов пробы может быть использовано любое физико-химическое свойство подвижной фазы (поглощение света, излучение света, электропроводность, показатель преломления и т.д.), которое изменяется при наличии в ней молекул разделяемых соединений. Из существующих 50 физико-химических методов детектирования в настоящее время активно используется 6.
Наибольшей сложностью при конструировании хроматографических детекторов было сочетание малых объемов ячеек с высокой чувствительностью (ввиду малого объема и низкой концентрации пробы).
В табл.3.7. приведены характеристики существующих детекторов хроматографов.
Таблица 3.7
| Характеристики детекторов хроматографов | |||
| Детектор | Измеряемое свойство | Чувствительность, мг | Селективность |
| Фильтровый фотометрический | Оптическая плотность на определенной длине волны, пропускаемой фильтром | 10-10 | Высокая |
| Спектрофото-метрический | Оптическая плотность на выбранной длине волны мо-нохроматора | 10 -9 | Высокая |
| Рефрактометрический | Разность показателей преломления растворителя и раствора с пробой | 10-6 | Низкая |
| Флуориметри-ческий | Интенсивность излучения молекул пробы в элюенте | 10-11 | Очень высокая |
| Амперометри-ческий | Ток окисления или восстановления электрохимически активных соединений | 10-9 - 10-11 | Очень высокая |
| Рекомендуем посмотреть лекцию "11 Система права". Кондуктомет-рический | Электропроводность ионов пробы в элюенте (воде) | 10-10 | Низкая |
Чувствительность - это важнейшая характеристика детектора. Лучше всего оценивать этот параметр по физической величине. Если определять чувствительность через двойную амплитуду шума нулевой линии, шум выражать в физических единицах, то чувствительность фотометрического детектора будет выражаться в единицах оптической плотности, рефрактометрического - в единицах показателя преломления, вольтамперометрического - в амперах, кондук-тометрического - в сименсах.
Чувствительность детектора может быть примерно одинаковой ко всем компонентам пробы, а может быть совершенно разной даже для близких соединений. В первом случае говорят о неселективном детектировании. Это значит, что измеряется физическое свойство, присущее и пробе и растворителю (показатель преломления, электропроводность). Во втором случае - селективное детектирование, что позволяет измерять физическое свойство, присущее только молекулам пробы, например, способность флуоресцировать или поглощать свет. Селективное детектирование, с одной стороны, позволяет повысить чувствительность определения или исключить те вещества, которые определять не нужно (предельные углеводороды при определении ароматики), с другой стороны, допускает возможность не обнаружить нужных нам компонентов (те же предельные углеводороды в нефти). Поэтому при исследовании общего состава объекта лучше использовать неселективный детектор типа рефрактометра, при определении концентрации отдельных компонентов в сложной смеси лучше использовать селективные детекторы.
