Биохимические основы патологии клетки. Митохондриальная медицина
Лекция по клинической биохимии “Биохимические основы патологии клетки. Митохондриальная медицина”
Клетка является структурно-функциональной единицей живых систем. Для эукариотических клеток характерна высокая степень пространственной организации и дифференциации отдельных элементов клеточных структур. В клетке, являющейся сложной метаболической системой, осуществляется совокупность огромного числа разнообразных реакций. Отдельные биохимические процессы локализованы в определенных участках клетки (принцип компартментализации). Не менее важна и координация метаболизма во времени, что позволяет клетке, будучи термодинамически открытой системой, поддерживать различные виды гомеостаза, т.е. быть саморегулирующейся системой.
В процессе жизнедеятельности клетка может находиться в состоянии пролиферации или дифференцировки, что, в свою очередь определяется фазой клеточного цикла. Известно, что большинство клеток взрослого организма находятся в фазе Go (фазе покоя), т.е. не пролиферируют и выполняют высоко специализированные функции. Вместе с тем, в ряде физиологических состояний (обновление тканей, регенерация) или при патологических процессах (опухолевый рост) происходит стимуляция выхода клеток в стадию G1 клеточного цикла, во время которой происходит подготовка клетки к синтезу биомакромолекул, осуществляемому в фазу S. Следующая фаза G2 клеточного цикла регулирует процессы подготовки к митозу, в том числе репликацию ДНК, после прохождения стадии M (митоз) клеточный цикл повторяется. Эндогенными регуляторами клеточного цикла являются циклины и циклин-зависимые киназы – специфические белки, осуществляющие фосфорилирование белков, участвующих в процессах репликации, транскрипции, синтеза белков и пр. Остановка клетки в какой-либо из фаз клеточного цикла (т.н. арест) блокирует дальнейшее прохождение клетки по циклу, и вызывает, как правило, клеточную гибель.
В процессе роста клетки большая часть ее компонентов образуется постепенно и непрерывно. На фоне этого непрерывного роста происходит ряд резких изменений, связанных с критическими моментами клеточного цикла. Например, для большинства клеток существует критическая точка в фазе G1, когда в их клеточном цикле наступает пауза, если условия среды неблагоприятны для роста (точка рестрикции).
Для пролиферации клеток требуются факторы роста (полипептидные моекулы, синтезируемые различными клетками и действующие ауто- или паракринно). К числу такого факторов роста относятся тромбоцитарный фактор роста, эпидермальный фактор роста, инсулиноподобные факторы роста, трансформирующий фактор роста, фактор роста фибробластов, фактор роста нервов, колониестимулирующие факторы, эритропоэтин, интерлейкины. Благодаря этим молекулам клетки в ткани взаимодействуют друг с другом (“социальный” контроль пролиферации). Известный феномен “контактного ингибирования” интерпретируется в настоящее время как проявление конкуренции клеток за факторы роста. Факторы роста действуют через специфические рецепторы (интегральные мембранные белки), которые при активации подвергаются димеризации, аутофосфорилируются и запускают каскадный механизм фосфорилирования внутриклеточных белков, что, в конечном счете, изменяет экспрессию генов.
Основой жизнедеятельности клеток является поддержание нескольких видов гомеостаза:
1. Генетический гомеостаз (постоянство генетического материала клетки, как ядерной, так и митохондриальной ДНК). Контролируется ферментативной системой репарации ДНК.
2. Энергетический гомеостаз (постоянство продукции и расхода энергии в клетке). Контролируется сбалансированностью гликолитических процессов, окислительного фосфорилирования в митохондриях, работой АТФаз и метаболических путей, утилизирующих макроэрги.
3. Окислительно-восстановительный гомеостаз (постоянство соотношения окислительных и восстановительных эквивалентов в клетке). Контролируется процессами синтеза и утилизации восстановленных и окисленных форм пиридиновых и флавиновых нуклеотидов, продукцией и разрушением реактивных форм кислорода, тиоловых соединения, работой антикосидантных систем.
Рекомендуемые материалы
4. Метаболический гомеостаз (сбалансированность процессов анаболизма и катаболизма). Контролируется функционированием большого количества ферментов, являющихся, в свою очеередь, объектом регуляции сигнальных каскадных путей регуляции, запускаемых активацией клеточных рецепторов.
5. Ионный гомеостаз (сбалансированность процессов трансмембранного транспорта ионов, их депонирования и высвобождения из внутриклеточных структур). Контролируется активностью ионных каналов, внутриклеточных ионных депо и системой внутриклеточных мессенджеров, регулирующих их функционирование.
Межклеточная сигнализация осуществляется за счет непосредственных контактов клеток друг с другом, а также за счет продукции химических сигнальных молекул, взаимодействующих с тремя типами рецепторов.
Мембранам принадлежит особая роль в регуляции клеточного метаболизма. Мембраны представляют собой сложные структуры толщиной 6-10 нм, состоящие в основном из белков и липидов Общепринятой моделью строения мембран является жидкостно-мозаичная, предложенная в 1972 г. С.Синджером и Дж. Николсоном. Согласно этой модели, мембрана – это подвижная мозаика, образованная вязкой липидной фазой и погруженными в нее белками (трансмембранные и примембранные белки). Главную часть липидной фракции мембран составляют фосфолипиды (80-90%). Липидный матрикс мембран двойной, углеводородные длинные цепи жирных кислот обращены друг к другу и образуют гидрофобную толщу мембраны, а полярные группы (фосфатные и спиртовые) направлены кнаружи. Интегральные мембранные белки тоже содержат гидрофобные и гидрофильные части молекул, первые вступают во взаимодействие с гидрофобными частями липидных молекул, вторые – располагаются в поверхностном слое мембран, контактируют с полярными «головками» липидов. Мембрана представляет собой динамичную структуру. Наиболее подвижным компонентом в ней являются липиды (например, флип-флоп переход). Молекулы белков также могут перемещаться латерально (например, кластеризация рецепторов перед их интернализацией). Белковые молекулы не абсолютно свободно перемещаются в плоскости мембраны, поскольку могут существовать взаимодействия между отдельными белковыми молекулами, между белками мембран и цитоскелетом клетки. Подвижность мембранных молекул в значительной мере зависит от состава жирных кислот. Важным фактором, влияющим на текучесть мембраны, служит холестерин. Хотя холестерин делает липидный бислой менее текучим, при его высоких концентрациях он предотвращает слипание и кристаллизацию углеводородных цепей фосфолипидов. Холестерин уменьшает проницаемость мембраны для малых водорастворимых молекул, увеличивает упругость и механическую прочность бислоя. Мембраны клетки имеют значительное количество ионных каналов и белков-переносчиков, осуществляющих транспорт ионов. Процессом, осуществляемым в мембране клетки, является эндоцитоз и экзоцитоз, что важно для интернализации комплекса «лиганд-рецептор», фагоцитоза.
Согласно современным представлениям, способность эукариотических клеток сохранять определенную форму, поддерживать стабильность мембран, а также осуществлять направленные и координированные движения, перемещение клеточных органелл в цитоплазме, регулировать межклеточные взаимодействия обусловлена наличием у них цитоскелета – сложной сети белковых нитей, пронизывающих цитоплазму. Структура цитоскелета представлена микротрубочками, микрофиламентами, промежуточными филаментами.
Участки тесной связи между мембраной и цитоскелетом с одной стороны и мембраной и внеклеточным матриксом, с другой, называются фокальными комплексами адгезии. Их формирование происходит с участием таких молекул, как FAK, паксиллин, а также структурных и актин-связывающих белков (талин, винкулин, тензин, a-актинин), что обеспечивает взаимосвязь между микрофиламентами и молекулами адгезии (интегрины). Регуляция функциональной активности белков цитоскелета осуществляется их посттрансляционной модификацией, многие из этих процессов Са2+-зависимы. Продемонстрировано участие системы малых ГТФ-связывающих белков в регуляции активности цитоскелета. Интенсивно изучается значение белков теплового шока, в частности, hsp27, а также митоген- и стресс-активируемых протеинкиназ в реализации изменений активности цитоскелетных структур при действии физиологических и патологических стимулов.
Одним из важных компонентов патогенеза широкого круга заболеваний является окислительный стресс – состояние, характеризующееся избыточной продукцией свободных радикалов и снижением антиоксидантной защиты клетки, в результате чего происходит повреждение липидов биологических мембран (ПОЛ), окисление клеточных белков и окисление азотистых оснований нуклеиновых кислот.
Продукция свободных радикалов является физиологическим процессом, возникает при функционировании дыхательной цепи митохондрий, цитохром-Р450-редуктазы (в обоих случаях – за счет т.н. феномена «утечки электронов» с цитохромов), активности мембран-связанной НАДФН-оксидазы (обеспечивающей фагоцитарную активность макрофагов). Существует предположение о том, что свободные радикалы являются универсальными «вторичными посредниками» в передаче сигнала от активированных рецепторов, коль скоро многие из компонентов сигнальных каскадных внутриклеточных путей (рецепторы, протеинкиназы) являются редокс-регулируемыми белками, т.е. их активность может быть направленно изменена за счет окисления или восстановления функциональных групп аминокислот (прежде всего, цистеина). Доказательством такого предположения является и то, что существующие в клетках ферменты (протеиндисульфидизомераза, тиоредоксин) реализуют свое специализирвоанное действие за счет направленной модуляции редокс-статуса клеточных белков. Активность одного из важных транскрипционных факторов NF-kB, контролирующего экспрессию колоссального количества генов, подавляется клеточными оксидантами и контролируется уровнем внутриклеточного цистеина и восстановленного глутатиона.
Гиперпродукция свободных радикалов возникает при дисфункции дыхательной цепи митохондрий (например, в периоде реперфузии после острой гипоксии), при усиленной активности ферментов системы микросомального окисления. Сопутствующее истощение ферментных и неферментных клеточных антиоксидантных механизмов (глутатионпероксидаза, супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза, глутатион, витамин С, витамин Е) способствует проявлению активности оксидантов.
В результате ПОЛ происходит увеличение пассивной проницаемости мембраны для низкомолекулярных соединений, образование сшивок между компонентами липидного бислоя, нарушение текучести мембраны и, следовательно, затруднение активности трансмембранных белков – рецепторов, ферментов, ионных каналов. Липидные гидропероксиды потребляют клеточные антиоксиданты (аскорбат, восстановленный глутатион), фрагментируются на реактивные радикалы (например, алкоксил радикал) за счет взаимодействия с ионами металлов или другими радикалами. Продукты окисления полиненасыщенных жирных кислот (гидропероксиды жирных кислот и 4-гидроксиноненал) являются токсичными для клеток.
Окисление клеточных белков приводит к потере ими четвертичной и третичной структуры (денатурация), увеличению степени гидрофобности, увеличению чувствительности к действию внутриклеточных протеолитических ферментов, потере специфической функции. Важным моментом является то, что окислительно поврежденные белки, несмотря на то, что происходит их ренатурация или протеолитическое разрушение, могут аккумулироваться в клетке, провоцируя дальнейшее повреждение клеточных молекул. На этом, в частности, базируется современная теория старения. Подобно окисленными липидам, гидропероксиды белков потребляют клеточные редуктанты, вступают в реакции с металлосодержащими молекулами, что запускает каскадный механизм образования радикалов.
Окисление нуклеотидов нуклеиновых кислот имеет своим результатом нарушение транскрипционных и репликационных механизмов, что, в свою очередь, приводит к образованию мутаций, остановке клеточного цикла и гибели клетки (при формировании нерепарабельных повреждений).
Одним из следствий окислительного стресса является истощение внутриклеточной концентрации НАД, который используется в качестве субстрата для фермента поли-АДФ-рибозилполимераза, обеспечивающего полирибозилирование белков хроматина и регулирующего таким образом процессы репликации и репарации ДНК. Значительное повреждение ДНК инициирует механизмы репарации, что, в свою очередь, приводит к снижению концентрации НАД, нарушению функционирования митохондрий, нарушению кальциевого гомеостаза.
Такого рода повреждения клеточных молекул вызывают каскад реакций, включающих в себя нарушение митохондриальной системы транспорта электронов, декомпартментализацию клеточного кальция (выход кальция из внутриклеточных депо и накопление в свободном виде в цитоплазме), активацию протеаз, фосфолипаз, эндонуклеаз.
Доказанной считается роль окислительного стресса в патогенезе ишемически-реперфузионных осложнений, нейродегенеративных заболеваний (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, рассеянный склероз), иммунодефицитных состояний, токсического поражения клеток, лучевой болезни, атеросклероза, катаракты, бронхопульмональной дисплазии, артритов.
Интересно, что некоторые классические антиоксиданты (например, витамин С) могут проявлять прооксидантные свойства, так как существуют в паре «окисленный/восстановленный эквивалент». Так, была продемонстрирована связь между кислородотерапией и развитием ретинопатии у недоношенных детей.
Одним из важных защитных механизмов, активируемых при оксилительном повреждении, помимо антиоксидантной системы, является индукция активности белков теплового шока (БТШ). Эта группа белков включает белки с разной молекулярной массой (от 27 до 90 кДа), которые выполняют ряд конститутивных функций (рецепция стероидных гормонов, регуляция клеточного цикла, поддержание стабильности белков цитоскелета, транспорт полипептидов через митохондриальные мембраны). При аккумуляции в цитоплазме денатурированных белков, вызванной действием протеотоксических агентов (при гипертермии, окислительном стрессе, действии тиолотропных ксенобиотиков, тяжелых металлов) происходит активация чаперонной активности БТШ: они связываются с денатурировавшими полипептидами и обеспечивают их ренатурацию (энергия – за счет АТФазной активности БТШ). Ренатурация белков протекает в несколько этапов, в том числе через состояние «расплавленной глобулы» (переходное состояние). Результатом действия БТШ являются ренатурация белков, предотвращение их неспецифической агрегации и седиментации, предотвращение протеолитической деградации. В динамике окислительного стресса или иного протеотоксического воздействия происходит индукция синтеза новых БТШ, что обеспечивает поддержание состояния компенсации на протяжении нескольких суток. Высокая концентрация в клетках БТШ обеспечивает т.н. «перекрестную термотолерантность» - нечувствительность клетки к действию других протеотоксических факторов. Так, показано, что направленная индукция синтеза БТШ в ткани миокарда существенно снижает площадь зоны некроза клеток при острой ишемии.
Апоптоз, в отличие от некроза, является физиологическим и генетически контролируемым процессом и выступает в качестве важного компонента гомеостаза многоклеточного организма. Одним из ключевых отличий некроза от апоптоза является, как долгое время считалось, относительная сохранность целостности и функции биомембран при развитии запрограммированной клеточной смерти, препятствующая выходу содержимого клетки в экстрацеллюлярное пространство и являющаяся условием формирования апоптотических телец, эффективно фагоцитируемых окружающими клетками. Вместе с тем, в последние годы стал накапливаться экспериментальный материал, свидетельствующий о значительной роли повреждения мембран клетки в динамике развития апоптоза. При этом происходят специфические и регулируемые процессы в цитоскелете, в мембранах клеточных органелл и наружной плазматической мембране, степень выраженности которых может определять скорость достижения состояния необратимости в развитии апоптоза.
Инициация апоптоза может происходит за счет активации специфических клеточных рецепторов Fas (APO-1/CD95), экспрессируемых на поверхности большинства клеток. Их лиганд (FasL) экспрессируется на лимфоцитах или находится во внеклеточной среде в растворимом состоянии). При взаимодействии Fas рецептора с Fas лигандом происходит активация специфического комплекса примембранных белков, формирующих Fas-ассоциированный домен клеточной гибели и запускающих каскад каспаз. Каспазы – это основные внутриклеточные “исполнители” программы апоптоза. Каспазы являются протеолитическими ферментами, активируемыми реакцией ограниченного протеолиза, и вызывающими протеолиз белков-мишеней (негистоновые белки хроматина, белки цитоскелета, клеточные рецепторы) по остаткам аспартата. Регуляция активности каспаз может осуществляться и по редокс-контролируемому пути (через обратимое окисление/восстановление остатков цистеина в молекуле каспаз). Существует две группы каспаз: инициаторные (каспаза-8, каспаза-9, каспаза-10) и “исполнительные” (каспаза-3, каспаза-6, каспаза-7). Таким образом, сущность процесса апоптоза заключается в активации специфического процесса внутриклеточного протеолиза, имеющего своим результатом разрушение ключевых ядерных и цитоплазматических белков.
Диагностика повреждения клетки основывается на идентификации во внеклеточном пространстве внутриклеточных ферментов, определении концентрации мочевины и мочевой кислоты, исследовании маркеров апоптоза.
Так, катаболизм клеточных нуклеотидов может являться индикатором гибели клеток организма, в частности, при увеличении концентрации β-аминоизомасляной кислоты в моче можно говорить об усилении распада ДНК (эта кислота является продуктом распада тимина ДНК), а при увеличении в моче концентрации β-аланина – о распаде РНК (урацил) или ДНК и РНК (урацил, цитозин). Увеличение концентрации мочевой кислоты в плазме крови и в моче свидетельствует, помимо прочих причин, об увеличении распада АМФ и ГМФ, что обычно связано с повреждением клеток, например, при ишемии или окислительном стрессе.
В настоящее время представления о развитии гиперферментемии при патологии заключаются в следующем:
1. Выход ферментов в кровяное русло обусловлен повреждением тканей на фоне продолжающегося (и даже усиленного) биосинтеза ферментов. Иными словами, длительность гиперферментемии прежде всего обусловлена тем, что выход ферментов из пораженных тканей и снижение их содержания в клетках стимулируют по принципу обратной связи их синтез.
2. При гиперферментемии, как правило, наблюдается увеличение каталитической активности ферментов как непосредственно в поврежденном органе, так и при поступлении их в кровяное русло.
На скорость высвобождения ферментов из клеток влияют концентрационный градиент фермента, его молекулярная масса, внутриклеточная локализация фермента.
Интересно, что если факторы, воздействующие на скорость высвобождения различных ферментов из поврежденных клеток в той или иной мере ясны, то процесс инактивации и удаления из кровяного русла вышедших из клеток ферментов до сих пор во многом неясен. Относительные молекулярные массы большинства внутриклеточных ферментов превышают 65000, поэтому экскреция их с мочой не может играть существенной роли в удалении ферментов из крови (во всяком случае, для большинства из них). Число ферментов, выводимых с желчью, также весьма ограничено. На основании ряда работ был сделан вывод о том, что ферменты в активной форме не сорбируются из крови какими-либо тканями и не накапливаются в них, скорее всего, первоначально в плазме крови происходит их инактивация, а затем уже ферменты улавливаются и подвергаются катаболизму в клетках различных тканей.
В настоящее время признано, что нарушение функционирования митохондрий играет ключевую роль в развитии клеточного повреждения. Одним из существенных вопросов, связанных с пониманием особенностей такого повреждения в клетках различной природы, является наличие т.н. «точки возврата» - момента, достижение которого делает невозможным восстановление исходных структур и реализацию компенсаторных процессов. Одним из ключевых событий в этом является формирование мегаканалов в мембране митохондрий, обеспечивающих выход веществ во внемитохондриальное пространство (ионы, нуклеотиды, цитохром с), с последующим торможением процессов окислительного фосфорилирования и стимуляцией продукции реактивных форм кислорода в клетке.
При окислительном стрессе резистентность митохондрий к повреждению лимитируется редокс-статусом внутримитохондриальных никотинамидных нуклеотидов, в частности, НАД(Ф)Н, который регулируется в том числе сохранность пула внутримитохондриального глутатиона. Внутримитохондриальный пул НАДФ(Н) регулируется трансгидрогеназой, активность которой в митохондриальной мембране контролируется протон-движущей силой. Если амплитуда протон-движущей силы чрезвычайно высока, комплекс III дыхательной цепи начинает избыточно генерировать свободные радикалы, если низка – снижается синтез АТФ и пул НАДФ(Н) окисляется. Редокс-статус также регулирует открытие мегаканалов в мембране митохондрий (см. ниже).
Митохондрии имеют два механизма высвобождения кальция – Na-Ca обмен, работающий в пассивном режиме (реагирует на повышение внутримитохондриального кальция), а также MPT, представляющие собой большие неселективные ионные каналы, открывающиеся при увеличении внутримитохондриального рН, изменении редокс-потенциала, снижении уровня АТФ, значение этих каналов особенно велико при развитии апоптоза и некроза. Таким образом, увеличение внутриклеточной концентрации кальция вызывает вход кальция во внутриклеточные депо, что активирует механизм высвобождения кальция в цитоплазму, обеспечивая восстановление исходного уровня.
Установлено, что концентрация кальция в митохондриях в покое соответствует концентрации этого иона в цитозоле. Для некоторых типов клеток было показано, что митохондрии могут выполнять роль внутриклеточных электровозбудимых органелл, амплифицируя кальциевый сигнал ЭПР. Так, митохондрии могут захватывать кальций из микродоменов с локально высокой концентрацией кальция в цитоплазме, при этом меняется активность некоторых ферментов (пируватдегидрогеназа, оксиглутаратдегидрогеназа, НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа), что стимулирует синтез АТФ в митохондриях. Интересно, что стимуляция клеток вызывает увеличение внутримитохондриального уровня кальция на порядок выше, чем в цитоплазме (10 и 1 мкМ, соответственно). Небольшие транзиторные деполяризации митохондриальной мембраны, возникающие при захвате кальция этими органеллами, быстро компенсируются стимуляцией окислительного фосфорилирвоания. В целом, вход кальция в митохондрии вызывает активацию митохондриального метаболизма, реполяризацию митохондриальной мембраны и восстановление содержания кальция в митохондриях.
Интересно, что за счет такого рода механизмов может осуществляться т.н. митохондриальная память – увеличение концентрации кальция вызывает последующую гиперстимуляцию ферментов дыхательной цепи, вероятно, вследствие неких конформационных изменений.
Плазматическая мембрана и внутриклеточные кальциевые депо быстро доставляют кальций в цитоплазму, открывая ионные каналы, и затем медленно удаляют его с помощью процессов активного транспорта. Напротив, митохондрии быстро удаляют кальций из цитоплазмы с помощью унипортера, и затем более медленно экспортируют кальций в цитозоль с помощью Na/Ca обменника. Таким образом, плазматическая мембрана и ЭПР создают короткоживущие домены с высокой концентрацией кальция, а митохондрии захватывают этот кальций и затем медленно возвращают его в цитоплазму.
Во многих клетках митохондрии очень близко (700 нм) расположены от ЭПР и могут образовывать тубулярную сеть. Благодаря недавним исследованиям, проведенным с использованием трансмиссионной электронной микроскопии и GFP-связанными белками, установлено, что в клетках существует «митохондриальный ретикулум» (МР), который располагается на протяжении всей клетки. Не исключено, что в пределах этого ретикулума существуют участки с локальной протонной цепью, что поддерживает высокий мембранный потенциал в участках сопряжения. Кроме того, этот ретикулум может определенным образом разделяться на фрагменты, например, во время деления клетки. Более интересная находка заключалась в том, что МР может образовывать прямые контакты с ЭПР (наподобие синапсов, до 60 нм).
Было показано, что в митохондриях может осуществляться синтез цАДФР за счет активности присутствующей там НАД-гликогидролазы (активность в 4 раза меньше, чем в плазматической мембране), митохондриальная НАД-гликогидролазная активность локализована в наружной мембране митохондрий. В отличие от фермента плазматической мембраны, который фиксируется в мембране за счет гликозилфосфоинозитольного якоря, НАД-гликогидролаза митохондрий удерживается в мембране за счет гидрофобных взаимодействий. Предполагается, что образование цАДФР из НАД в митохондриях происходит при окислительном стрессе, что вызывает высвобождение кальция из митохондрий (а не как ранее считалось, в результате неферментативного рибозилирования белков).
Интенсивно изучается повреждение митохондрий при некрозе и апоптозе. В патогенезе некроза митохондрии рано подвергаются набуханию (вследствие нарушения осмотического давления внутри митохондрий), что останавливает работу дыхательной цепи. В отличие от некроза, при апоптозе происходят сложные скоординированные процессы постепенного нарушения функционирования митохондрий. На первом этапе апоптоза митохондрии высвобождают апоптотические факторы через внешнюю мембрану и рассеивают электрохимический градиент внутренней мембраны. Изменение проницаемости митохондриальной мембраны обеспечивается динамическим мультипротеиновым комплексом, сформированным в участке контакта между внутренней и наружной митохондриальными мембранами (mitochondrial permeability transition, MPT). МРТ-комплекс может функционировать и как сенсор для каких-либо стрессовых воздействий, и как промежуточное звено для передачи сигнала рецепторам. Точная структура МРТ-комплекса до сих пор неизвестна. В настоящее время считается, что в его состав входят протеины цитозоля (гексокиназы), протеины наружной мембраны (порин), периферические бензодиазепиновые рецепторы, потенциал-зависимый анионный канал, интермембранные белки (креатинкиназы), не менее чем один протеин внутренней мембраны - аденин-нуклеотид-транслокатор и, по крайней мере, один протеин матрикса - циклофилин D. МРТ-комплекс может также взаимодействовать с добавочным мультипротеиновым комплексом, комплексом транспортера внутренней мембраны, комплексом транспортера наружной мембраны и Вcl-комплексом. В окружении МРТ-мегаканалов располагаются редокс-чувствительные сульфгидрильные группы белков, модификация которых является одним из механизмов влияния клеточного редокс-гомеостаза на стабильность и проницаемость мембран митохондрий. Проницаемость мегаканалов, образующихся при активации МРТ-комплекса, обеспечивает высвобождение во внемитохондриальное пространство молекул с массой до 1500 Да, при этом комплекс практически не имеет ионной селективности. Естественным модулятором активности МРТ-каналов выступает Вcl-комплекс, что является несомненным доказательством роли окислительного стресса в изменении проницаемости митохондриальной мембраны. Белки-представители семейства Bcl преимущественно локализованы на внешней митохондриальной мембране в участках ее контакта с внутренней мембраной, и имеют, как правило, трансмембранные домены, позволяющие им встраиваться во внутриклеточные мембраны, подобно некоторым бактериальным токсинам, и формировать ион-селективные каналы. Установлено, что с одной стороны, Вcl-2 предотвращает апоптоз-ассоциированное высвобождение каспаз- и нуклеаз-активирующих факторов из митохондриального интермембранного пространства (действуя, таким образом, на наружной митохондриальной мембране), с другой стороны, этот белок блокирует открытие МРТ-мегаканалов, а также подавляет генерацию свободных радикалов при апоптозе.
На втором этапе апоптоза последствия дисфункции митохондрий (падение внутреннего митохондриального трансмембранного потенциала, разобщение дыхательной цепи, гиперпродукция супероксид-анион радикалов, нарушение митохондриального биогенеза, высвобождение из матрикса кальция и глутатиона, растворимых протеинов) являются причиной активации специфических апоптотических протеаз митохондриальными протеинами - цитохромом с, апоптоз-индуцирующим фактором (АИФ) с вторичной активацией эндонуклеаз.
Открытие MPT-комплекса происходит и при некрозе, и при апоптозе, однако развитию некроза предшествует биоэнергетическая и окислительно-восстановительная катастрофа в клетке, тогда как ключевым моментом в патогенезе апоптоза является активация катаболических ферментов (каспаз и нуклеаз). Иными словами, клетка погибает путем первичного некроза, если апоптогенные протеазы не могут быть активированы вследствие фармакологического воздействия или если период времени, в течение которого могла бы произойти их активация, значительно сокращен или они инактивированы на начальном этапе повреждения клетки при выраженном окислительном стрессе.
Последние достижения в изучении структуры и функционирования митохондрий привели к пониманию того, что ряд наследственных и приобретенных заболеваний являются следствием митохондриальной дисфункции – т.н. митохондриальные болезни. Впервые такого рода предположения были сделаны в 1988 году, когда нарушения структуры митохондриальной ДНК были идентифицированы как причина наследственной патологии. В настоящее время известно около 100 мутаций мтДНК, которые приводят к развитию клиники заболеваний, тяжелых по течению и приводящих нередко к летальному исходу. Несмотря на то, что изначально клинические проявления могут быть рестриктированы одним органом, эти заболевания прогрессируют по типу полиорганного поражения.
В настоящее время частота встречаемости патогенных мутацией мтДНК неизвестны. По статистике неврологических клиник (где чаще всего наблюдаются пациенты с такой патологией), их частота может достигать 1 на 50000, что, однако, считается заниженной величиной, с учетом того, что многие пациенты не обследуются на наличие митохондриальной патологии.
Известно, что работа дыхательной цепи митохондрий необходима для метаболизма аэробных клеток. Каждая митохондрия содержит множественные копии мтДНК, кодирующей 13 полипептидов дыхательной цепи. Патогенные мутации, таким образом, наиболее выраженно проявляются в клетках, максимально зависящих от аэробных процессов синтеза АТФ: нейроны, мышечные клетки, β-клетки поджелудочной железы, клетки эндокринных делез, кардиомиоциты, клетки канальцев почек, гепатоциты, клетки ЖКТ (в убывающей последовательности). Гематологические и дерматологические проявления также наблюдаются, но гораздо реже. Известен синдром деплеции митохондриальной ДНК, который проявляется неврологическими нарушениями и патологией печени. Интересно, что несмотря на то, что большее число белков, участвующих в работе дыхательной цепи, кодируется ядерной ДНК, большинство пациентов с клиникой митохондриальных заболеваний имеют идентифицируемые дефекты мтДНК.
Работа дыхательной цепи митохондрий заключается в переносе электронов между белками-цитохромами, локализованными на поверхности или в глубине внутренней митохондриальной мембраны. Железосерные центры этих ферментов функционируют совместно с флавин-содержащими ферментами, принимая электроны от сукцинатдегидрогеназы и дегидрогеназ, участвующих в окислении жиров. Единственным небелковым переносчиком электронов является убихинон, который при восстановлении приобретает не только электроны, но и протоны. При одноэлектронном восстановлении он превращается в семихинон (органический свободный радикал), а при двухэлектронном – в гидрохинон. Именно промежуточное образование свободного радикала позволяет убихинону служить переносчиком не двух, а одного электрона. Итак, митохондриальная электронтранспортная цепь содержит ФМН-белок, белки, содержащие негемовые железо-серные центры, убихинон, не связанный с белком и свободно перемещающийся в неполярном слое внутренней митохондриальной мембраны, цитохромы (гемопротеиды). Поток электроно между переносчиками направлен от переносчика с более высоким восстановительным потенциалом (т.е. меньшим редокс-потенциалом) к переносчику с более низким восстановительным потенциалом (т.е. более окисленному, с большим редокс-потенциалом), при этом постепенно уменьшается изменение свободной энергии, т.е. на каждом этапе высвобождается свободная энергия. Задача электронтранспортной цепи заключается в переносе электронов от НАДН и ФАДН2 на кислород, чему способствует активность нескольких комплексов:
I – НАДН-КоА-редуктаза
II – сукцинат-КоА-редуктаза
III – КоQН2 – цитохром с редуктаза
IV – цитохромоксидаза.
Цитохромоксидаза передает электроны с цитохрома с (с внешней стороны внутренней митохондриальной мембраны) на кислород. На пути к кислороду эти электроны проходят через цитохромы а, содержащие ионы меди. Важно, чтобы цитохромоксидаза передала кислороду все четыре электрона, необходимые для его восстановления в воду, а не в какие-либо частично восстановленные продукты: перекись водорода или реакционноспособные свободные радикалы.
Механизм синтеза АТФ из АДФ и фосфата, сопряженный с транспортом электроном, принципиально отличается от субстратного фосфорилирования в процессе гликолиза: в последнем случае синтез АТФ неотделим от собственно гликолитических реакций, т.е. реакция не протекает без образования АТФ. Точно так же обстоит дело с синтезом ГТФ в цикле лимонной кислоты.
Каждая молекула АТФ потребляется в течение минуты после ее образования. Окислительное фосфорилирование никогда не бывает полностью сопряженным, митохондрии имеют пассивную проницаемость для протонов, не сопряженных с синтзеом АТФ (утечка протонов). Вероятно, утечка протонов необходима для поддержания температуры тела, обеспечения некоторых метаболических процессов, подавления продукции свободных радикалов, регуляции поступления углерода в клетку.
Хотя электронтранспортная цепь функционирует именно ради синтеза АТФ, транспорт электронов происходит и в поврежденных митохондриях, которые вообще не способны синтезировать АТФ. Это происходит вследствие наличия сопряжения транспорта электронов с синтезом АТФ, т.е. это два параллельно протекающих процесса. Поток электронов вызывает выкачивание протонов из митохондрий в окружающую среду, создавая градиент протонов через мембрану (отрицательный заряд на стороне матрикса митохондрий, положительный заряд на внешней стороне мембраны), т.е. возникает протондвижущая сила (трансмембранный митохондриальный потенциал. АТФ-синтазные комплексы F0, F1 используют эту энергию для синтеза АТФ. На поверхности мембраны, обращенной к матриксу, атомы водорода формируются из протонов, забираемых из матрикса, и электронов, поставляемых электронтранспортной цепью. Эти атомы образуются на молекуле убихинона, превращающегося в восстановленную форму. Она диффундирует к противоположной стороне мембраны, где события протекают в обратном направлении: электроны отщепляются от атомов водорода, а образующиеся протоны уходят наружу. Иными словами, убихинон восстанавливается на одной стороне мембраны, а на другой стороне мембраны окисляется (существуя в двух редокс-парах, разнесенных по обе стороны мембраны и способных передавать атомы водорода через мембрану с одной поверхности на другую). Каждой паре электронов, перенесенных от НАДН на кислород, соответствует 10 протонов, перекачанных из митохондриального матрикса. Таким образом, окисление одной молекулы НАДН должно привести к синтезу 2,5 молекул АТФ. Окисление молекулы ФАДН2 (что эквивалентно молекуле сукцината) – к синтезу 1,5 молекул АТФ. Молекулы НАДН, образовавшиеся в ходе гликолиза, находятся в цитозоле. Они отдают свои пары электронов либо внутримитохондриальному НАД, либо митохондриальному ФАД, в зависимости от того, какой челночный механизм преобладает в данной клетке. Благодаря этой неопределенности одной цитоплазматической молекуле НАДН отвечает синтез 1,5-2,5 молекул АТФ.
Если в процесс окисления вступает молекула глюкозы, а не гликогена, валовый выход АТФ из расчета на полностью окисленную молекулу субстрата составляет от 30 до 32 молекул: некоторое количество АТФ синтезируется в ходе субстратного фосфорилирования: 2 АТФ поставляет гликолиз (синтезируются четыре, но две расходуются) и еще две АТФ образуются в цикле лимонной кислоты (из одной молекулы глюкозы образуется 2 ацетил-КоА, запускающие два оборота цикла). В процессе субстратного фосфорилирования синтезируются четыре молекулы АТФ, а все остальные образуются в митохондриях с участием цепи переноса электронов. При гликолизе в цитоплазме образуется также две молекулы НАДН на одну молекулу глюкозы, их окисление увеличит выход АТФ на 3-5 молекул. Кроме того, в расчете на молекулу глюкозы, пируватдегидрогеназа производит дву молекулы НАДН, а цикл лимонной кислоты – шесть молекул НАДН. Их окисление приводит к синтезу 20 молекул АТФ. Еще три молекулы АТФ образуются за счет окисления ФАДН2, при превращении сукцината в фумарат. Суммируя это, получаем 32 (30) молекул АТФ.
Многие лекарственные препараты, применяемые в лечении различных заболеваний, имеют «мишенью» своего действия митохондрии: антралин (антипсориатический препарат) – разобщитель окислительного фосфорилирования, вызывает нарушение энергообразования в кератиноцитах; хлорохин (антималярийный препарат, применяющийся также при лечении ревматоидного артрита) – снижается активность ферментов внутренней мембраны митохондрий; индометацин (НПВС) – разобщитель окислительного фосфорилирования; амиодарон (антиаритмический препарат) – оказывает прямой токсический эффект на митохондрии, нарушает синтез АТФ (следствием чего являются побочные эффекты в отношении лимфоцитов, гепатоцитов, альвеолоцитов); глибенкламид (сахароснижающий препарат) – частично разобщает митохондриальное дыхание, ингибирует АТФазы.
Ингибиторами комплекса I являются некоторые нейротоксины, миксотиазол, ротенон; ингибиторами комплекса III – антимицин, антигельминтные препараты; ингибиторами цитохром с оксидазы – цианиды, CO, NO, локальные анестетики; ингибиторами АТФ-синтазы – пропранолол, локальные анестетики, диэтилстилбестрол; разобщителями окислительного фосфорилирования – НПВС, антидепрессанты, антимикотические препараты; альтернативным акцептором электронов является адриамицин
Пациенты с митохондриальной патологией часто страдают от неврологических нарушений. Так, незначительная часть пациентов имеет синдромы MELAS (Mitochondrial encephalopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes), MERRF (Myoclonic epileplsy with ragged-red fibres), CPEO (Chronic progressive external ophthalmoplegia) и синдром Кернса-Сейр (офтальмоплегия, атаксия, глухота, блокады сердца). Подострая потеря зрения (билатеральная) у молодых пациентов может быть связна с наследственной оптической нейропатией Лебера (LHON).
Мутации мтДНК приводят к поражению различных компонентов нервной системы, но некоторые симптомы, особенно при их комбинации, дают право говорить о наличии митохондриальной этиологии заболевания: например, поражения глаз (офтальмоплегия, диплопия, атрофия оптического нерва, периферическая пигментная ретинопатия, катаракта). Пациенты с митохондриальным заболеванием могут иметь нормальное раннее развитие до начала подострой энцефалопатии, приводящей к поражению нервной системы и развитию деменции, в том числе, с судорожным синдромом. Не менее редким симптомом является мозжечковая атаксия, а также симптомы поражения пирамидального и экстрапирамидального трактов.
В настоящее время не вызывает сомнений ассоциация митохондриальных дефектов с развитием мигрени, инсульта (в случае отсутствия в анамнезе сердечно-сосудистой патологии, нарушения свертывающей системы крови или васкулитов). Более 50% пациентов с митохондриальной патологией страдают мигренью, которая, в некоторых случаях приводит к развитию эпизодов нарушения мозгового кровообращения. В частности, в 0,5-8% случаев инсульта у молодых пациентов были найдены мутации мтДНК.
Сахарный диабет, имеющий митохондриальную этиологию, составляет до 1,5% случаев сахарного диабета. Обычно он развивается в молодом и среднем возрасте (22-35 лет), т.е. занимает промежуточное положение между ИЗСД и ИНЗСД. Это, вероятно, отражает аккумуляцию мутантной мтДНК в пост-митотических β-клетках. Митохондриальный диабет является следствием дефекта секреции инсулина. Большинство таких пациентов имеют сниженную массу тела, вынуждены прибегать к высоким дозам инсулина, в то время как кетоацидоз развивается редко. Что же следует считать митохондриальным диабетом: многие пациенты имеют сочетание диабета с неврологической симптоматикой, в частности, нарушением слуха.
β-клетки поджелудочной железы являются высокозависимыми от аэробного метаболизма, в частности, секреция инсулина зависит от внутриклеточного соотношения АТФ/АДФ. Гистологически у таких пациентов обнаруживается атрофия островков поджелудочной железы и атоантитела в периферической крови к β-клеткам. До сих пор неясно, является ли аутоиммунный ответ вторичный по отношению к повреждению этих клеток или напрямую связан с дефектами мтДНК.
Частым признаком митохондриальной патологии является гипопаратиреоидизм, который также сочетается с циркуляцией в крови аутоантител. В отдельных случаях отмечался дефицит гормона роста, а также нарушения переднего отдела гипофиза. Бесплодие явдяется частым симптомом митохондриального заболевания, что является следствием сочетания нескольких факторов (первичная патология гонад, эндокринопатия, системные метаболические нарушения, потеря гамет вследствие высокого уровня мутаций).
Поражение сердца у больных митохондриальными заболеваниями выражается в дилятационной и гипертрофической кардиомиопатии, нарушении проводящей системы сердца. Ишемическое поражение кардиомиоцитов является вторичным и вызвано свободно-радикальным повреждением клеток.
Вследствие лактат-ацидоза у пациентов с митохондриальной патологией часто развивается гипервентиляция, в то же время, при тяжелой энцефалопатии возникает гиповентиляция центрального генеза, что часто сопровождается смешанным респираторным и метаболическим ацидозом.
Аминоацидурия (лактат, пируват, аланин) часто обнаруживается у пациентов с митохондриальными заболеваниями, что обычно отражает системные метаболические нарушения, а не патологию почек. В целом, гломерулярная патология редка при этих заболеваниях, однако частой находкой является канальцевая дисфункция. Около 90% кислорода используется в клетках проксимальных канальцев для образования АТФ, необходимомо для работы Na/K-АТФазы. Поэтому нарушения активности АТФ-генерирующей системы митохондрий приводит к неселективной потере аминокислот, глюкозы, фосфато ви бикарбонатов (синдром Тони-Фанкони-Дебре).
Гастроэнтерологи могут наблюдать митохондриальную патологию у пациентов, страдающих от эпизодов тошноты и рвоты, что обычно связано с неврологическими нарушениями, а также лактат-ацидозом. Кроме того, достаточно характерным является нарушение моторной функции желудочно-кишечного тракта, мальабсорбция (атрофия ворсинок, нарушение функции пищевариетльных желез).
Поражение печени является важным симптомом митохондриальной патологии, особенно в раннем возрасте. Первичные митохондриальные гепатопатии являются следствием наследственных дефектов в белках, участвующих в синтезе АТФ в митохондриях, окислении жирных кислот, цикле мочевины. Вторичные митохондриальные гепатопатии являются следствием поражения митохондрий при других заболеваниях (отравление тяжелыми металлами, токсинами, хроническое алкогольное поражение).
Среди других проявлений заболеваний митохондриальной этиологии – анемия, извращенные реакции на лекарственные препараты (антивирусные, например, азидотимидин), психическая патология (серьезная депрессия в сочетании с одышкой (вследствие метаболического ацидоза), мышечной слабостью и хронической усталостью). Интересно, что симптомы митохондриального заболевания могут имитировать синдром хронической усталости.
В неонатальном периоде митохондриальные заболевания могут имитировать некоторые метаболические заболевания (дефицит биотинидазы), они обычно проявляются клиникой синлрома Лея (энцефалопатия (дефект цитохром соксидазы или пируватдегидрогеназы, связан с Х-хромосомой).
Таким образом, заболевание митохондриальный этиологии должно быть заподозрено в случае сочетания внешне несвязанных симптомов, особенно, если часть из них – неврологического характера.
Специфические лабораторные исследования в случае наличия митохондриальной патологии включают в себя:
1. Уровень лактата в крови и спинно-мозговой жидкости (лактат-ацидоз вследствие нарушения окислительного фосфорилирования), активность креатинкиназы в крови (повышение вследствие миопатии). Уровень аминокислот в моче (повышение вследствие тубулярной дисфункции).
Рекомендация для Вас - Риск-менеджмент в страховании.
2. ЭЭГ, компьютерная томография, МР исследование мозга (ЭЭГ-признаки подострой энцефалопатии, инфаркты и снижение плотности или кальцификация в базальных гангиях, участки интенсивного сигнала в сером и белом веществе мозга).
3. Биопсия мышц (гистохимическое исследование, молекулярно-генетический анализ): субсарколеммная аккумуляция митохондрий..
4. Анализ клеток периферической крови и других клеток на наличие мутаций мтДНК. Необходимо помнить о том, что, как правило, имеются одновременно мутантные и нормальные молекулы мтДНК в одной клетке (внутриклеточная гетероплазмия). Легче всего идентифицировать мтДНК мутации (вследствие их высокой частоты) в клетках скелетных мышц.
Лечение митохондриальной патологии носит пока в большей степени симптоматический характер: убихинон (коэнзим Q10),витамины С, К, рибофлавин, тиамин.
Необходимо отметить, что нарушение митохондриальной функции характерно для ряда заболеваний другой этиологии, например, оно возникает при ишемии и реперфузии миокарда, в Т-лимфоцитах периферической крови у носителей ВИЧ.
Нарушение функционирования митохондрий прогрессирует по мере старения организма.
