Лабораторная диагностика
В. Лабораторная диагностика
2.6. Патологический материал
От больных животных берут кровь в период лихорадочного состояния, а также фракции лейкоцитов, мазки из носа и конъюнктивы. От свежих трупов (не менее чем 3-4) мазки-отпечатки со слизистых оболочек глаз, век, носовой полости и других отделов респираторного тракта, мочевого пузыря, миндалин, лимфатических узлов, кусочки лёгкого, трахеи, селезёнки, почек, головного мозга, мочевой пузырь.
Для серологических исследований берут кровь как можно быстрее после проявления клинических признаков и повторно спустя 14-21 день. Материал отправляют нарочным в термосе со льдом. Подготовку материала для выделения вируса проводят общепринятым методом.
2.10. Индикация вируса
Игнатов П.Е. (1995) отмечает, что имеющиеся в настоящее время методы лабораторной диагностики (РДСК, РПГА и ИФА) дают нестабильные результаты и что наиболее перспективным представляется обнаружение вируса в экскретах с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Этот метод позволяет обнаружить вирус в первые дни заболевания в крови, в носовых и конъюнктивальных смывах, а также в патологическом материале (селезенка, печень, почки, головной мозг и др.). ПЦР характеризуется высокой специфичностью и чувствительностью. Чувствительность обратного транскрипционного варианта при проведении с праймерами р1 (АСА, JJА, ТTJ, СTJ) и р2 (САА, JAN, AAC, CAT, JTA, CCJ) гена N составляет 86-88%. Тест-систему для обнаружения вируса чумы плотоядных методом полимеразной цепной реакции производят НПО «Нарвак» и ФГУ ВГНКИ.
С помощью ПЦР следует исследовать материал от невакцинированных собак с обязательным подтверждением диагноза другими методами.
Был предложен экспресс-метод индикации в РИГА антител к вирусу чумы плотоядных, позволяющий получить результат в течение 3 часов. Желательно исследовать парные пробы сывороток (с определенным интервалом), чтобы проследить рост или спад титров антител, однако и однократного взятия бывает достаточно для заключения о состоявшемся контакте непривитого животного с вирусом чумы. По чувствительности несколько превосходит РН.
Предлагалось много других методов — РДП, РСК и др., но широкое их применение не состоялось. Не оправдал себя и гистопатологический метод выявления цитоплазматических телец-включений в эпителии слизистых оболочек (мочевого пузыря и др.) из-за того, что после прививки живой вирус-вакциной образуются аналогичные включения (Уласов В.И., 2001) и др. Кроме того, ряд авторов признают, что на результат гистологических исследований влияют профессионализм исследователя, качество и давность приготовления красителей, наличие секундарной микрофлоры у павшего животного. И, наконец, обнаружение включений в клетках различных тканей должно быть интерпретировано только как предостережение, т.к. многие дегенеративные поражения клеток, фагоцитоз, другие вирусные инфекции (герпесвирусная, бешенство) могут приводить к образованию сходных структур. В то же время ультраструктурные и иммуногистохимические исследования предоставляют возможность отдифференцировать эти включения и избежать ошибок. Однако поствакцинальные включения надежнее всего можно исключить лишь с учетом времени прививок — вакцинный вирусный антиген сохраняется в лимфоидной системе норок 6-12 дней (Blixenkrone-Moller М., 1989), у собак — еще дольше. Геллер В.И. и др. (2003) указывают, что поствакцинальные включения у пушных зверей исчезают через 60 дней. Однако, как бы то ни было, диагностика по тельцам-включениям или вирусному антигену даже с учетом вышеизложенного не может быть точной, так как в зависимости от давности заражения они могут или не развиться, или уже исчезнуть. Официально этот метод не зарегистрирован в нашей стране, однако его используют как дополнительный тест при постановке диагноза.
Рекомендуемые материалы
Однако в нашей стране все еще производится индикация вируса с помощью таких методов, как РДП, РИФ, МФА.
Реакция диффузной преципитации (РДП). Преципитирующий АГ появляется в органах животных на 3-4-й день болезни и всегда обнаруживается в органах павших животных. В качестве антигенов используют 10%-ую суспензию органов больных животных (селезенка, лимфоузлы, костный мозг, тимус, головной мозг, легкие, печень, почки, слюнные железы, поджелудочная железа, моча, перитоне-альная жидкость). Свиньи - хорошим источником антисывороток против ВЧП (2,4,5).
Реакция иммунофлуоресценции (РИФ). Позволяет поставить быстрый и ранний прижизненный диагноз. У хорьков самые надежные результаты при исследовании мазков крови. РИФ используют также для исследования кусочков органов от павших животных. Наиболее пригодны мозжечок, желудок, легкие, большой и продолговатый мозг. В РИФ антигены вируса чумы обнаруживали в мазках костного мозга, фиксированных ацетоном, в лейкоцитах крови и эпителиальных клетках конъюнктивы. В мононуклеарных клетках крови его обнаруживали на 2-3-й день после экспериментального заражения. Ряд авторов рекомендуют применять ИФ для обнаружения вирусного АГ в ЦНС, а также проводить гистологическое исследование препаратов мочевого пузыря, почечной лоханки и кожи.
Иммуноферментный анализ (ИФА) позволяет обнаружить вирус в секретах и экскретах животных одновременно с появлением клинических признаков болезни. Shestopalov A.M. et al. (1996), Сазонкин В.Н. (1998) успешно испытали твердофазный точечный ИФА на нитроцеллюлезе (dot-ИФА) для индикации вируса чумы собак в окулоназальных выделениях. Однако при исследовании паренхиматозных органов павших пушных зверей в некоторых зверохозяйствах Приморья встречались случаи ложных положительных результатов. Изредка такие же результаты можно получить и после вакцинации, но в большинстве случаев вакцинный вирус не выявлялся.
В 2002 г. сотрудники фирмы «Нарвак» разработали свой вариант ИФА для индикации антигена вируса чумы плотоядных в более широком ассортименте биологического материала — в конъюнктивальных и назальных смывах, в крови, головном мозге.
В стране зарегистрирован и серийно выпускается НПО «Нарвак» и ВНЦВиБ НПО «Вектор» набор для выявления антигена вируса чумы плотоядных иммуноферментным анализом (ИФА). Чаще применяют диагностикумы на полистироловых пластинах, чем на основе нитроцеллюлозы. Для выявления специфического антигена вируса используют пробы крови, смывы из глаз и глотки. Для исключения ложноположительных результатов этот метод нельзя применять при исследовании образцов паренхиматозных органов павших собак. На подготовку и проведение анализа проб уходит не более 2-3 часов.
Метод флуоресцирующих антител (МФА) при чуме собак применяют уже более 20 лет как рутинный при экспресс-диагностике. Широкое признание получил прямой метод, когда меченные ФИТЦ антитела наносят непосредственно на мазки-отпечатки. По чувствительности он незначительно уступает иммуноферментному анализу (ИФА). Однако в редких случаях у вакцинированных собак против чумы отмечена неспецифическая положительная реакция. Сущность метода заключается в соединении меченых антител со специфическим антигеном и в обнаружении светящихся комплексов антиген - антитело под люминесцентным микроскопом.
В связи с отсутствием стандартных по активности и специфичности коммерческих флуоресцирующих сывороток МФА как перспективный метод не нашел должного применения на практике.
Вирусоскопия, электронная и иммуноэлектронная микроскопия широко не используются.
2.11. Выделение вируса.
Выделение вируса осуществляется методом биопробы на чувствительных системах. В качестве материала берут кровь от больных собак в начальной стадии в период повышения температуры тела, а от павших - патматериал: селезенку, печень, почки, головной мозг. Готовят 10%-ю суспензию на физиологическом растворе или питательной среде, центрифугируют и внутримышечно вводят щенкам собак или тхорзофреткам. За подопытными животными ведут наблюдение в течение 1-1.5 месяцев. Наиболее чувствительными являются тхорзофретки, которые погибают через 7-10 суток с характерными клиническими признаками чумы. Щенки собак могут погибнуть значительно позже (1.5-2 месяца), иногда нельзя получить четких результатов, так как многие животные являются носителями антител к вирусу чумы плотоядных. Несмотря на то что этот метод дорогостоящий, он позволяет в короткий срок получить положительные результаты.
В первых пассажах вирс чумы плотоядных вызывает лишь слабое помутнение ХАО и гибель КЭ в 5-10% случаев. При дальнейшем пассировании поражение ХАО становится более выраженным. О наличии вируса судят по специфической гибели эмбрионов, поражению ХАО и РГА. При инокуляции в желточный мешок гибель эмбрионов наблюдается на 7-11-е сутки, титр вируса достигает 105-106 ЕЛД50/мл.
С помощью этого метода в культуре клеток можно выделить вирус. Его изолируют из смывов слизистых оболочек носовой полости, конъюнктивы, крови и патматериала. С диагностической целью этим пользуются довольно редко из-за сложности и длительности проведения, так как к изолятам вируса не все культуры клеток обладают чувствительностью и требуется его адаптация путем серийных пассажей, на что уходит много времени.
2.12. Идентификация выделенного вируса
Идентификация вируса проводится с помощью всех тех реакций, которые я рассматривала в главе 2.10, с добавлением реакции нейтрализации (РН), которая, к тому же, редко используется.
Её применяют для идентификации вируса в культуре клеток. Сущность реакции состоит в том, что к зараженной культуре добавляют питательную среду с 5%-ной специфической сыворотки сразу же после контакта вируса с культурой клеток. По подавлению ЦПД вируса судят о специфичности поражений клеточного монослоя.
Информация в лекции "55 «Вечный мир» с Россией 1686 г." поможет Вам.
2.13. Доказательство этиологической роли выделенного вируса
Доказательство этиологической роли выделенного вируса чумы собак ничем особо не отличается от остальных. Для этого используют парные сыворотки крови в серологических реакциях. В качестве АГ используют выделенный вирус, а в качестве АТ – парные сыворотки. Повышение титра антител во второй сыворотке в 4 и более раз свидетельствует о этиологической роли выделенного вируса.
2.14. Ретроспективная серодиагностика
Серологическая диагностика применяется лишь в экспериментальных целях. Серологические тесты, основанные на исследовании сывороток крови собак в РН и РНГА, показывают, что титры специфических антител к ВЧП широко варьируют у разных пород собак в зависимости от давности и тяжести течения инфекции.
Для ретроспективной диагностики ЧП используются РН, РСК, РДП. Объектом исследования в данном случае являются пробы сыворотки крови переболевших животных. Реакции выполняются общепринятыми методами. Наличие AT, выявляемых в любой из указанных реакций, в сыворотке крови животных свидетельствует о переболевании их чумой. Для выявления AT к ВЧП предложены РНГА, которая не уступает ELISA (29).
А.В. Васильев в 1996 г. разработали набор на основе сенсибилизированных эритроцитов, содержащий все необходимые компоненты в готовом виде: специфический ВЧП, эритроцитарный диагностикум, специфическую и отрицательную к ВЧП сыворотки, разбавитель и микропанель для постановки реакции. Набор можно использовать в ветеринарных лабораториях и других специализированных учреждениях. РНГА по сравнению с РН более чувствительна, совпадаемость результатов превышает 90%. В РНГА улавливают AT не только к поверхностным АГ вируса, но и ко всем вирионным белкам, а также выявляют AT в более низких титрах, ещё не улавливаемых в РН. При исследовании сывороток крови, полученных в динамике развития болезни, устанавливается 4-кратное увеличение титра AT (диагностический прирост титра) уже на 5-7-е сут. после первого взятия крови. Таким образом, РНГА, осуществляемая с помощью набора эритроцитарных диагностикумов, - быстрый, чувствительный, специфический и воспроизводимый метод выявления антител к вирусу чумы плотоядных. С помощью набора можно быстро подтвердить или исключить клинический диагноз - чума, при этом в спорных случаях образцы сыворотки необходимо дополнительно обработать меркаптоэтанолом для тестирования специфических IgM. Показано, что латексный AT диагностикум эффективен на ранней стадии болезни. Обнаружение антигенов к вирусу чумы плотоядных также возможно с использованием радиоактивных ДНК-РНК-зондов.
