Биотехнология

Лекция №11

БИОТЕХНОЛОГИЯ

Нет такого экспериментального подхода или исследователь­ского направления в биотехнологии, которые бы не получили применения в медицине. Вот почему столь многообразны связи между биотехнологией и самой гуманной из всех наук. Здесь мы остановимся лишь на основных моментах.

Антибиотики.

Антибиотики — это специфические продукты жизнедеятельности, обладающие высокой физиологической актив­ностью по отношению к определенным группам микроорганизмов и к злокачественным опухолям, избирательно задерживающих их рост или полностью подавляющих развитие (Н. С. Егоров, 1979). Далеко не все из этих соединений, число которых прибли­жается к 5000, допущены для применения в медицине. К важней­шим антибиотикам терапевтического назначения принадлежат следующие их классы (табл. 2).

Приведенные классы антибиотиков не исчерпывают их много­образия, список их пополняется с каждым годом. Причины неос­лабевающего внимания к поиску новых антибиотиков, как видно из табл. 10, связаны с токсичностью существующих антибиоти­ков, аллергическими реакциями, вызываемыми ими, нарастанием устойчивости патогенных микроорганизмов к применяемым пре­паратам и, помимо этого, с необходимостью изыскания средств борьбы с возбудителями, против которых недостаточно эффектив­ны известные ныне антибиотики. Основные пути поиска вклю­чают:

1. Испытание новых продуцентов. Так, с начала 80-х годов исследуют миксобактерии, продуцирующие большое количество антимикробных агентов (Н. Thierbach, N. Reichenbach, 1981).

2. Химическая модификация антибиотиков. Противомикроб-ные макролиды токсичны для человека. Например, гептаен амфо-терицин В, используемый по жизненным показаниям при тяже­лых микозах, вызывает необратимые поражения почек. Получены метиловые эфиры амфотерицина, менее токсичные и сохра­няющие противогрибковую активность. При модификации пенициллинов и цефалоспоринов ис­пользуют иммобилизованные ферменты.

Таблица    2.    Важнейшие классы антибиотиков терапевтического назначения  (по И  Г..  Егорову,  1979; Д.Ланчини, Ф   Паренти,  1985)

3. Мутасинтез. Применяют мутантные штаммы, у которых блокирован синтез отдельных фрагментов молекулы антибиотика. В среду культивирования вносят аналоги этих фрагментов. Мик­роорганизм использует эти аналоги для биосинтеза, в результате чего получают модифицированный антибиотик.

4. Клеточная инженерия. Получают гибридные антибиотики, например, с новыми комбинациями агликона и Сахаров.

5. Генетическая инженерия — введение в геном микроорганиз­ма информации о ферменте, необходимом для модификации про­дуцируемого антибиотика, например его метилирования при по­мощи метилаз.

Важной задачей является повышение эффективности биосин­теза известных антибиотиков. Значительных результатов удалось добиться за десятилетия селекции штаммов-продуцентов с приме­нением индуцированного мутагенеза и ступенчатого отбора. На­пример, продуктивность штаммов Penicillium по синтезу пеницил­лина увеличена в 300—350 раз. Определенные перспективы от­крываются в связи с возможностью клонирования генов «узких мест» биосинтеза антибиотика или в случае, если все био­синтетические ферменты кодируются единым опероном.

Многообещающим подходом служит инкапсулирование анти­биотиков, в частности их включение в лигюсомы, что позволяет прицельно доставлять препарат только к определенным органам и тканям, повышает его эффективность и снижает побочное действие. Этот подход применим и для других лекарственных препаратов. Например, кала-азар, болезнь, вызываемая лейгшма-нией, поддается лечению препаратами сурьмы. Однако лечебная доза этих препаратов токсична для человека. В составе липосом препараты сурьмы избирательно доставляются к органам, пора­женным лейшманией, — селезенке и печени.

Вместо антибиотика в организм человека может вводиться его продуцент, антагонист возбудителя заболевания. Этот подход берет начало с работ И. И.Мечникова о подавлении гнилостной микрофлоры в толстом кишечнике человека посредством молоч­нокислых бактерий. Важную роль в возникновении кариеса зу­бов, по-видимому, играет обитающая во рту бактерия Streptococ­cus mutans, которая выделяет кислоты, разрушающие зубную эмаль и дентин. Получен мутант Strept. mutans, который при введении в ротовую полость почти не образует коррозивных кислот, вытесняет дикий патогенный штамм и выделяет леталь­ный для него белковый продукт.

Гормоны.

Биотехнология предоставляет медицине новые пути получения ценных гормональных препаратов. Особенно большие сдвиги произошли в последние годы в направлении синтеза пеп-тидных гормонов.

Раньше гормоны получали из органов и тканей животных и человека (крови доноров, удаленных при операциях органов, трупного материала). Требовалось много материала для получе­ния небольшого количества продукта. Так, человеческий гормон роста (соматотропин) получали из гипофиза человека, каждый гипофиз содержит его не более 4 мг. В то же время для лечения одного ребенка, страдающего карликовостью, требуется около 7 мг соматотропина в неделю; курс лечения должен продолжать­ся несколько лет. С применением генноинже-нерного штамма Е. coli в настоящее время получают до 100 мг гормона роста на 1 л среды культивирования. Открываются пер­спективы борьбы не только с карликовостью, но и с низкорос-лостью — более слабой степенью дефицита соматотропина. Сома­тотропин способствует заживлению ран и ожогов, наряду с каль-цитонином (гормоном щитовидной железы) регулирует обмен Са²⁺ в костной ткани.

Инсулин, пептидный гормон островков Лангерганса подже­лудочной железы, представляет основное средство лечения при сахарном диабете. Эта болезнь вызвана дефицитом инсулина и проявляется повышением уровня глюкозы в крови. До недавнего времени инсулин получали из поджелудочной железы быка и свиньи. Препарат отличался от человеческого инсулина 1—3 аминокислотными заменами, так что возникала угроза аллерги­ческих реакций, особенно у детей. Широкомасштабное терапев­тическое применение инсулина сдерживалось его высокой стои­мостью и ограниченностью ресурсов. Путем химической модифи­кации инсулин из животных удалось сделать неотличимым от человеческого, но это означало дополнительное удорожание продукта.

Компания Eli Lilly с 1982 г. производит генноинженерный инсулин на основе раздельного синтеза Е. coli его А- и В-цепей. Стоимость продукта значительно снизилась, получаемый инсулин идентичен человеческому. С 1980 г. в печати имеются сообщения о клонировании у Е. сой гена проинсулина — предшественника гормона, переходящего в зрелую форму при ограниченном протеолизе.

К лечению диабета приложена также технология инкапсули-рования: клетки поджелудочной железы в капсуле, введенные однократно в организм больного, продуцируют инсулин в течение года.

Компания Integrated Genetics приступила к выпуску фолли-кулостимулирующего и лютенизирующего гормонов. Эти пептиды составлены из двух субъединиц. На повестке дня вопрос о про­мышленном синтезе олигопептидных гормонов нервной систе­мы — энкефалинов, построенных из 5 аминокислотных остатков, и эндорфинов, аналогов морфина. При рациональном примене­нии эти пептиды снимают болевые ощущения, создают хорошее

настроение, повышают работоспособность, концентрируют внима­ние, улучшают память, приводят в порядок режим сна и бодр­ствования. Примером успешного применения методов генетиче­ской инженерии может служить синтез р-эндорфина по техноло­гии гибридных белков, описанной выше для другого пептидного гормона, соматостатина.

Значителен вклад биотехнологии и в промышленное произ­водство непептидных гормонов, в первую очередь стероидов. Ме­тоды микробиологической трансформации позволили резко со­кратить число этапов химического синтеза кортизона, гормона надпочечников, применяемого для лечения ревматоидного артри­та. При производстве стероидных гормонов широко используют иммобилизованные микробные клетки, например Arthrobacter globiformis, для синтеза преднизолона из гидрокортизона. Име­ются разработки по получению гормона щитовидной железы ти­роксина из микроводорослей.

Интерфероны, интерлейкины, факторы крови.

Интерфероны выделяются клетками человека и животных в ответ на инфици-рование вирусами. Они обладают антивирусной активностью. Механизм действия интерферонов до конца не выяснен. Предполагается, в частности, что Интерфероны препятствуют проникновению вирусных частиц в клетку. Интерфероны стиму­лируют деятельность иммунной системы и препятствуют размно­жению клеток раковых опухолей. Все аспекты действия интер­феронов важны с точки зрения их терапевтического применения.

Различают a-, b-, g- и e-интерфероны, образуемые соответст­венно лейкоцитами, фибробластами соединительной ткани, Т-лимфоцитами и эпителиальными клетками. Наибольшее значение имеют первые три группы. Интерфероны состоят из 146—166 аминокислотных остатков, b - и g-интерфероны связаны с остат­ками Сахаров (гликозилированы). До введения методов генети­ческой инженерии интерфероны получали из донорской крови — до 1 мкг неочищенного интерферона из 1 л крови, т. е. примерно одну дозу для инъекции.

В настоящее время a-, b- и g-интерфероны успешно получают с применением генноинженерных штаммов Е. coli, дрожжей, куль­тивируемых клеток насекомых (Drosophila) и млекопитающих. Генно-инженерные интерфероны могут быть очищены с использо­ванием моноклональных антител. В случае у- и р-интерферонов предпочтительно применение эукариотических продуцентов, так как прокариоты не гликозилируют белки. Некоторые фирмы, на­пример Bioferon (ФРГ), используют не генноинженерные мутан­ты, а культивируемые in vitro фибропласты человека.

Интерфероны используются для лечения болезней, вызывае­мых вирусами герпеса, бешенства, гепатитов, цитомегаловиру-сом, вирусом, вызывающим опасное поражение сердца, а также для профилактики вирусных инфекций. Вдыхание аэрозоля ин­терферонов позволяет предупредить развитие острых респиратор­ных заболеваний. Несколько курьезной проблемой является то что интерфероны, в частности a-интерфероны, сами могут вызывать у пациентов простудные симптомы (насморк, повышение температуры и т.д.). Проблема побочного действия стоит особенно остро при длительном терапевтическом применении интерферонов, необходимом для лечения злокаче­ственных опухолей.

Интерфероны оказывают лечебное воздействие на организм больных раком груди, кожи, гортани, легких, мозга, рассеянной миеломе и саркоме Капоци — два последних заболевания харак­терны для лиц, страдающих приобретенными иммунодефицитами (см. ниже). Интерфероны полезны также при лечении рассеян­ного склероза.

Методы генетической инженерии позволяют получать модифи­цированные Интерфероны. Антивирусная активность интерферо­нов варьирует при аминокислотных заменах (J. Werenne, 1983). Американская компания Cetus Corporation производит b-интер-ферон, в аминокислотной последовательности которого цистеин в положении 17 замещен на серии. Это приводит к повышению терапевтической активности препарата, так как предотвращает наблюдаемое in vitro формирование неактивного димера b-интер-ферона за счет дисульфидных связей между остатками цистеина в положении 17. Определенные надежды возлагают на модифи­кацию интерферонов путем получения гибридных молекул (Е. Д. Свердлов, 1984).

Интерлейкины—сравнительно короткие (около 150 амино­кислотных остатков) полипептиды, участвующие в организации иммунного ответа. Интерлейкин-1, образующийся опре­деленной группой лейкоцитов крови — макрофагами, в ответ на введение антигена стимулирует размножение (пролиферацию) Т-хелперов (субпопуляции Т-лимфоцитов), продуцирующих, в свою очередь, интерлейкин-2. Последний вызывает пролифера­цию различных субпопуляций Т-лимфоцитов — Т-киллеров, Т-хелперов, Т-супрессоров, а также В-лимфоцитов, продуцентов антител. Под влиянием интерлейкина-2 из Т-лимфоцитов высво­бождаются регуляторные белки — лимфокины, активирующие звенья иммунной системы; синтезируются также Интерфероны.

Интерлейкины, основные лечебные средства при иммунных расстройствах, получают путем клонирования соответствующих генов в Е. coll или культивирования лимфоцитов in vitro. Англий­ская компания Celltech Ltd и японская Sakyo Company предла­гают синтезированный генноинженерными бактериями интерлей-кин-1 наряду с другим тюлипептидным агентом —фактором нек­роза опухолей -- для лечения ряда опухолевых заболеваний (В. Sikyta el al., 1986).

Получаемые биотехнологическим путем факторы свертывания крови, особенно фактор VIII (с помощью культивируемых кле­ток млекопитающих) и фактор IX (с помощью генноинженер-ного штамма Е. coli), необходимы для терапии форм гемофи­лии наследственной болезни, при которой кровь теряет способность свертываться. К числу ценных с клинической точки зрения факторов, полученных в биореакторах с культурами животных клеток, следует отнести фактор роста В-лимфоцитов, фактор активации макрофагов, Т-заместительный фактор, активатор тканевого плазминогена.

Моноклокальные антитела и ДНК-или РНК-пробы.

Моноклональные антитела — продукты В-гибридомных клеток  — используют для диагностики различных заболеваний. Об­ладая высокой специфичностью действия, они обеспечивают иден­тификацию не только вида возбудителя, но и его серотипа. С по­мощью моноклональных антител можно тестировать различные гормоны, метаболиты, белковые факторы. Наиболее быстрый ме­тод индикации основан на применении антител, иммобилизован­ных на мембранных электродах — аналогах ферментных биосен­соров. Они позволяют диагностировать беременность, выявлять предрасположенность к диабету, ревматоидному артриту (J. Col-lins et al., 1986), идентифицировать наследственные заболе­вания, сопровождающиеся утратой тех или иных ферментов и других белковых компонентов. Моноклональные антитела широко используют для диагностики рака и определения его форм.

Трудности связаны с тем, что специфических «раковых» анти­генов, по-видимому, не бывает, и характерные для злокачествен­но переродившейся клетки детерминанты могут быть с некоторой, пусть небольшой, вероятностью обнаружены и в здоровых клет­ках. Перспективна диагностика рака при помощи моноклональ-ных антител к вырабатываемым злокачественной опухолью осо­бым гормонам, аутокринам, ведущим к самостимуляции роста раковых клеток.

Моноклональные антитела имеют не только диагностическое, но и лечебное значение. При аутоиммунных заболеваниях, когда иммунные клетки «ополчаются» против собственных органов и тканей, моноклональные антитела соответствующей специфич­ности могут связывать антитела, наносящие вред организму больного. Для лечения рака предлагают использовать монокло­нальные антитела, конъюгированные с токсичными для раковых клеток соединениями. Моноклональные антитела доставляют яд точно по адресу, избегая поражения здоровых клеток. Поэтому к моноклональным антителам можно присоединять очень сильные токсины, например рицин — яд из клещевины, одной молекулы которого достаточно для поражения одной клетки. В современ­ной фармацевтической промышленности моноклональные анти­тела используют для очистки лекарственных препаратов.

Диагностическое значение имеют короткие фрагменты ДНК и РНК, несущие радиоактивную или иную метку, так называемые ДНК/РНК-пробы. С их помощью можно установить наличие в организме определенных типов нуклеиновых кислот, соответ­ствующих болезнетворным агентам, злокачественным опухолям, а также проверить геном пациента на наличие у него тех или иных генетических аномалий. Метод основан на комплементар­ном взаимодействии проб с участками ДНК или РНК, выделен­ными из исследуемых клеток и фиксированными на носителе. Взаимодействия нуклеотидных цепочек пробы с ДНК (РНК) из образца регистрируют по радиоактивной метке или иным спо­собом.

Моноклональные антитела и ДНК/РНК-пробы используют для диагностики болезней животных и растений. В частности, с помощью этих проб проводят индикацию зараженности кар­тофеля вирусом. Диагностические средства из арсенала биотех­нологов предлагают применять для быстрого определения пола у цыплят.

Рекомбинантные вакцины и вакцины-антигены.

Вакцина­ция — один из основных способов борьбы с инфекционными забо­леваниями. Путем поголовной вакцинации ликвидирована нату­ральная оспа, резко ограничено распространение бешенства, по­лиомиелита, желтой лихорадки. На повестке дня — изготовление вакцин против гриппа, гепатитов, герпесов, свинки, кори, острых респираторных заболеваний. Большое экономическое значение имеет разработка вакцин против болезней сельскохозяйственных животных — ящура, африканской болезни лошадей, овечьей бо-

лезни «синего языка», трипаносомозов и др. Традиционные вакцин­ные препараты изготовляют на основе ослабленных, инактивиро-ванных или дезинтегрированных возбудителей болезней.

Современные биотехнологические разработки предусматрива­ют создание рекомбинантных вакцин и вакцин-антигенов. Вак­цины обоих типов основаны на генноинженерном подходе.

Для получения рекомбинантных вакцин обычно используют хорошо известный вирус коровьей оспы (осповакцины). В его ДНК встраивают чужеродные гены, кодирующие иммуногенные белки различных возбудителей (гемагглютинин вируса гриппа, гликопротеин D вируса герпеса, поверхностный антиген вируса гепатита В, антиген малярийного плазмодия). Получаются вак­цины против соответствующих инфекций, хорошо зарекомендо­вавшие себя в опытах на животных. К их достоинствам относится возможность создания поливалент­ных вакцинных препаратов на основе объединения участков ДНК различных патогенов «под эгидой» ДНК вируса осповакцины. Открывается возможность одномоментной комплексной иммуни­зации, скажем, крупного рогатого скота против всех опасных инфекций данной местности.

Вакцины-антигены получают, клонируя гены возбудителя бо­лезни в Е. colt, дрожжах, клетках насекомых и млекопитающих. Клонирован ген поверхностного антигена HBS-вируса гепатита В (сывороточного гепатита), ген белка оболочки УРЬвируса ящура. Вирус ящура существует в виде многих серотипов, методом белковой инженерии удалось скомбини­ровать иммуногенные компоненты различных серотипов в рамках одной вакцины-антигена.

Рекомендация для Вас - 1 - Введение в физиологию.

Вакцины-антигены высокостабильны при хранении и перевоз­ке, сравнительно просты в изготовлении (в том числе и при крупномасштабном производстве), содержат минимальное коли­чество белка и поэтому малоопасны как аллергены. Они гаран­тированы от остаточной инфекционности — способности вызы­вать инфекционную болезнь вместо того, чтобы предохранять от нее. Проблемой является низкая иммуногенность вакцин-антигенов. Одной из причин может быть то, что вакцина не включает всех компонентов возбудителя, необходимых для созда­ния иммунитета к нему. Так, вирус, покидая клетку, часто «одевается» ее мембраной. Компоненты этой мембраны, отсут­ствующие в генноинженерном белке, могут обладать иммуноген-ными свойствами. К повышению иммуногенности вакцин-анти­генов ведет добавление адьювантов, иммобилизация вакцин на носителях или их включение в липосомы.

Ферменты медицинского назначения.

Многообразно примене­ние ферментных препаратов в медицине. Их используют для растворения тромбов, лечения наследственных заболеваний (вместо отсутствующих эндогенных ферментов), удаления не-

жизнеспособных, денатурированных структур, клеточных и тканевых    фрагментов,    освобождения    организма    от    токсических веществ    (Н.   Ф.    Казанская   и   др.,    1984).    Яркий   пример-спасение   жизни   больных    с   тромбозом    конечностей,   легких, коронарных    сосудов    сердца    при    помощи    громболитически.х ферментов   (стрсптокиназы,   урокиназы).   В  СССР такие  препа­раты   созданы   в   иммобилизованной   форме   под   руководством Е.  И.  Чазова   и  И.   В.   Березина.   Ген  урокнназы  клонирован  в бактериях  (S. Prentis, 1984). В современной медицине протеазы применяются для очистки очагов гнойно-некротических процессов от   патологических   продуктов,   а   также   для   лечения   ожогов Лечение рака связано с использованием  L-аспарагиназы,  кото рая лишает раковые клетки ресурсов необходимого для их раз вития    аспарагина,    поступающего    с    током    крови.    Здоровые клетки   в   отличие   от   раковых   (некоторых   типов)   способны   к самостоятельному синтезу аспарагина.

Известно около 200 наследственных заболеваний, обуслов ленных дефицитом какого-либо фермента или иного белкового фактора. В настоящее время делают попытки лечения этих заболеваний с применением ферментов. Так, пытаются лечить болезнь Готе, при которой организм не способен расщеплять, глюкоцереброзиды (S. Prentis, 1984).

В   последние   годы   все   больше   внимания   уделяют   ингиби­торам  ферментов.  Ингибиторы  протеаз,  получаемые  из  актино мицетов   (лейпептин, антипаин, химостатин и др.)   и генноинже нерных штаммов Е. coil  (эглин)   и дрожжей  a-1 антитрипсин) оказываются   полезными   при   септических   процессах,   инфаркте миокарда, эмфиземе легких, панкреатите. Уменьшение концентрации глюкозы в крови больных диабетом  может быть достигнуто при  исполь зовании ингибиторов кишечных инвертаз и амилаз, отвечающих за превращение крахмала и сахарозы в глюкозу.  Особой задачей является  поиск  ингибиторов ферментов, с   помощью   которых   патогенные   микроорганизмы   разрушают антибиотики, вводимые в организм больного.

Таковы основные направления биотехнологических разрабо­ток в области медицины. Без преувеличения можно сказать что центральное приложение новейших биотехнологических под­ходов — медицина. Одной из проблем, связанных с белками медицинского назначения, является наличие у них побочных эффектов. Например, аллергические реакции возникают как против генноинженерных белков, так и против моноклональных антител, даже если их получают на основе человеческих гиб­ридом. Эта проблема не нова для медицины и не является непреодолимой.