Видовой состав и свойства биопленкообразующих бактерий при хронических отитах у собак и совершенствование методов лечения больных животных

Актуальность темы и степень ее разработанности. Хронические отиты собак представляют существенную проблему для ветеринарной медицины в результате широкого распространения болезни и сложностей лечения животных (Усевич В.М., 2010; Плешакова В.И., 2014; Scott D.W., 2001; Zur G., 2013). У собак при хронических отитах в 80% случаев выявляются биопленкообразующие бактерии, обладающие множественной лекарственной устойчивостью (Грязнева Т.Н., 2018; Bjarnsholt T., 2013 и др.). Биопленки – это сообщества микроорганизмов, которые окружены матриксом, состоящим из полимерных внеклеточных веществ, синтезируемых бактериями и прикрепленных к какой-либо биотической или абиотической поверхности. Важным свойством биопленок является высокая устойчивость находящихся в них микроорганизмов к различным факторам внешней среды, самым значимым из которых является антибиотикоустойчивость (Чеботарь И.В., 2012; Costerton J.W., 2015). В последние два десятилетия в нарастающих масштабах в медицине проводятся исследования роли биопленочных инфекций при различных патологиях (Сидоренко С.В., 2003; Божкова С.А., 2013; Trautner W.B., 2004; Stoodley P., 2011). В отечественной ветеринарии научные работы в данном направлении единичны. Недостаточно изучена этиология биопленочной инфекции, не разработаны методические подходы к разрушению биопленок и эффективные методы лечения собак с хроническими отитами, вызванными биопленкообразующими бактериями (Плешакова В.И., 2013; Уткина Т.М., 2014; Карабанов С.Ю., 2015). Поэтому, актуальным в научном и практическом аспектах является изучение видового состава и биологических свойств биопленкообразующих бактерий при хронических отитах у собак, разработка и усовершенствование методов лечения животных.
Степень разработанности проблемы. Теоретической базой для исследований послужили работы таких ученых, как Хмель И.А., 2011; Гостев В.В., Сидоренко С.В., Лямин А.В., Чеботарь И.В., Окулич В.К., Скородумов Д.И. 2012; Тец В.В., Чернявский В.И., 2013; Donlan R.M., 2002; Pace J.L., Finch R.G., 2006; Proal A., 2008; Percival S.L., Knottenbelt D.C., Cochrane C.A., Cruz H., Williams D.W. 2011 и др. В отечественной ветеринарии имеются отдельные работы по этиологии и специфике лечения животных с биопленочной инфекцией (Скородумов Д.И., 2012), которые не затрагивают проблему хронических отитов у собак. Тема работы является составной частью научных исследований, проводимых кафедрой микробиологии ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К.И. Скрябина».
Цель исследований – изучить видовой состав и свойства биопленкообразующих бактерий ушных каналов собак при хронических отитах и усовершенствовать методы лечения больных животных.
Для решения были поставлены следующие задачи: 1. Изучить видовой состав микрофлоры, а также различные ассоциации микроорганизмов в слуховом канале собак при хронических отитах. 2. Определить in vitro способность этиологически наиболее значимых и часто обнаруживаемых при отитах собак микроорганизмов к формированию биопленки. 3. Определить антибиотикочувствительность выделенных из слухового канала собак микроорганизмов, входящих в состав биопленки. 4. Создать биологические модели отитов с биопленочной инфекцией и определить на их основе эффективность различных схем антибиотикотерапии в сравнительном аспекте. 5. Разработать эффективный метод повышения антибиотикочувствительности бактерий в составе биопленки. 6. Определить бактерицидное действие антибиотиков и ферментного комплекса «Вобэнзим» в отношении биопленкообразующих бактерий, выделенных при хронических отитах у собак. 7. Провести клинические испытания нового метода лечения собак при хронических отитах с использованием антибиотиков и ферментного препарата «Вобэнзим» и внедрить его в ветеринарную практику.
Научная новизна. Впервые определены виды микроорганизмов, способных формировать биопленки при отитах собак, дана количественная оценка интенсивности образования ими биопленки в слуховом канале собак при воспалительных процессах. Впервые проведено сравнительное изучение бактерицидного действия различных антимикробных препаратов на культуры S. aureus, S. intermedius и P. aeruginosa, находящиеся в «планктонном виде» и в составе биопленки. Созданы биологические модели отитов с биопленочной инфекцией и определена эффективность различных схем антибиотикотерапии. Впервые визуализировано разрушение биопленки под действием антибиотиков и ферментов. Установлено in vitro снижение резистентности бактерий в фенотипе биопленки к антибиотикам в присутствии ферментного препарата «Вобэнзим». Предложен новый методический подход по повышению эффективности терапии собак при хронических отитах с использованием антибиотиков и ферментных препаратов.
Теоретическая и практическая значимость. На основе проведенных исследований определен состав микрофлоры, ассоциирующийся с хроническими отитами собак и способность отдельных ее представителей формировать биопленки, что послужило обоснованием для разработки нового метода лечения животных при данной патологии как биопленочной инфекции. В опытах на созданных биологических моделях отитов изучен патогенез болезни, выявлена высокая антибиотикорезистентность бактерий, находящихся в составе биопленки, определена в сравнительном аспекте эффективность различных схем антибиотикотерапии животных. Получен комплект фотографий, на которых поэтапно зафиксирован процесс разрушения биопленки антибиотиками и ферментами. Разработана схема лечения собак при отитах с использованием антибиотиков в сочетании с ферментным препаратом «Вобэнзим». Данная схема лечения животных прошла клинические испытания в ветеринарных клиниках Москвы, что подтверждено актами, утвержденными в установленном порядке, и внедрена в практику ветеринарии специалистами клиник «ВетТал» и «Крошка Ру» (г. Москва). Установлена безвредность и эффективнось применения ферментного препарата «Вобэнзим» при хронических отитах собак с биопленочной инфекцией, что подтверждено результатами исследований клинических, микробиологических и гематологических показателей организма экспериментальных животных. По результатам исследований составлен и утвержден отчет о научно-исследовательской работе «Изучение видового состава биопленкообразующих бактерий, выделенных от собак, больных хроническим отитом». Результаты исследований используются в учебном процессе на кафедре микробиологии ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА имени К.И. Скрябина при преподавании студентам дисциплины «Ветеринарная микробиология и микология» и аспирантам – дисциплины «Экология бактерий».
Методология и методы исследований. Объектами количественных и качественных клинических, гематологических, микробиологических исследований выступали собаки разных пород и возрастов с поражением слухового канала, обусловленного биопленкообразующими микроорганизмами, а также лабораторные животные – биологические модели отита и разные виды бактерий и грибов, выделенные от животных. В качестве лабораторно-клинических методов использовались бактериологический и микологический методы исследований микрофлоры слухового канала больных хроническим отитом собак и биологических моделей, биохимический и гематологический методы анализа крови животных, а также иммунобиологический метод при изучении свойств биопленкообразующих бактерий.
Степень достоверности. Результаты работы были получены при использовании сертифицированного оборудования и приборов, прошедших поверку средств измерений, согласно ГОСТ 8.513-84, и определяются достаточным количеством проведенных исследований. Микробиологические исследования биоматериала проводились на базе лицензированной и аккредитованной лаборатории отдела санитарной и клинической микробиологии ФГБУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов». Полученные экспериментальные данные определяются достаточным количеством проведенных микробиологических и клинических исследований, на большой выборке животных. Результаты исследований обработаны методом статистического анализа.
Соответствие паспорту специальности. Диссертационная работа выполнена в следующих областях исследований: природа и происхождение, структура, химический состав, морфологические, биологические, физико-химические свойства патогенных бактерий и грибов; теоретические и прикладные проблемы экологии микроорганизмов; культивирование бактерий и грибов; природа патогенности, явления, процессы и механизмы взаимодействия микро- и макроорганизмов на клеточном, тканевом, организменном, популяционном уровнях в условиях воздействия экзогенных факторов; методы выделения микроорганизмов из патологического материала, индикация патогенных микроорганизмов; средства и методы лечения и лекарственной профилактики инфекционных болезней животных. Работа соответствует паспорту специальности 06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология.
Апробация работы. Основные результаты работы изложены в отчетах НИР и доложены на XIII Междунар. научно-практич. конференции «Проблемы современной биологии» (Москва, 2014); на международной конференции «Современные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных» (Москва, 2016) и на заседаниях ученых советов ветеринарно-санитарного факультета ФГБОУ ВО МГУПП (Москва, 2014, 2015) и факультета ветеринарной медицины ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА имени К.И. Скрябина (Москва, 2018), где получили положительную оценку.
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 4 научные статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ (Ветеринария; Российский ветеринарный журнал; Ветеринария Кубани; Ветеринария, зоотехния и биотехнология), 1 статья опубликована в материалах международной научнопрактической конференции.
Личный вклад автора. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Автору принадлежат организация и непосредственное осуществление микробиологических, гематологических и клинических исследований; создание биологических моделей отита с биопленочной инфекцией; разработка нового метода лечения собак с использованием антибиотиков и комплекса ферментов; проведение клинических испытаний препаратов в условиях ветеринарных клиник; анализ результатов исследований и обработка полученных данных. При выполнении работы консультативную помощь оказывали доктор ветеринарных наук, профессор кафедры ветеринарносанитарной экспертизы и биологической безопасности ФГБОУ ВО МГУПП Скородумов Д.И. и заведующий лабораторией ветеринарной клиники «ВетТал» Тютюнников А.В., которым выражаю глубокую благодарность за помощь и поддержку.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 146 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, заключение, список использованной литературы (206 источников, из них 70 отечественных и 136 иностранных авторов) и 10 стр. приложений. Работа содержит 29 таблиц и 30 рисунков.