Кандидатская диссертация: Сравнительная эффективность живых вакцин “Ливакокс Q” и “Эвалон” против эймериоза кур

Актуальность проблемы. Птицеводство в России и по всему миру, занимает лидирующее положение среди всех отраслей животноводства. Эймериоз кур, возбудителем которого служат паразитические простейшие, является одним из наиболее экономически значимых заболеваний в промышленном птицеводстве. В связи с развитием мультирезистентности эймерий к антикокцидийным препаратам и ограничением их применения в выращивании племенной птицы, перед производителями встала необходимость фундаментального пересмотра способов выращивания птицы, а также более тщательного рассмотрения альтернативных средств профилактики эймериоза. В связи с этим сегодня на первое место в борьбе с эймериозом выходит иммунопрофилактика. Большое внимание уделяется оптимизации конструкции вакцин, не ставящих под угрозу, а улучшающих сохранность и продуктивность птицы. Достижение этой цели требует понимания поствакцинальных процессов и умения регулировать формирование иммунного ответа в нужном направлении. В настоящее время создаются вакцины против эймериоза нового поколения, которые призваны стимулировать мукозальный клеточный иммунитет птицы с помощью специальных адъювантов и методов вакцинации. В связи с этим стоит вопрос сравнительной оценки поствакцинальных реакций со стороны слизистой кишечника и факторов локального иммунитета после применения аттенуированных вакцин «Ливакокс Q» (Biopharm, Чешская республика), традиционно используемой в птицеводстве, и «Эвалон» (Hipra Lab., Испания) с адъювантом Montanide™ против эймериоза кур при вакцинации спрей-методом.
Степень разработанности темы. На сегодняшний день существует недостаточно зарубежных и практически отсутствуют отечественные исследования по оценке локального иммунитета кишечника кур, в частности после вакцинации против эймериоза. Анализ эффективности вакцин позволил бы всесторонне оценить протективные механизмы мукозального иммунитета и побочные эффекты вакцинации на морфологию кишечника кур и его функциональное состояние.
Цель исследования - комплексная сравнительная оценка поствакцинальной реакции тонкого и толстого отделов кишечника кур и эффективности аттенуированных вакцин против эймериоза «Ливакокс Q» и «Эвалон».
В задачи исследования входили: 1.Вакцинация кур кросса Хайсекс Браун живыми аттенуированными вакцинами «Ливакокс Q» и «Эвалон». 2. Оценка динамики прироста живой массы птицы и конверсии корма после вакцинации кур исследуемыми вакцинами. 3. Определение динамики выделения ооцист эймерий, входящих в состав исследуемых вакцин в окружающую среду. 4. Оценка патологоанатомических и гистоморфологических данных поствакцинальной реакции слизистой оболочки кишечника. 5. Гистоморфометрическая оценка функционального состояния слизистой оболочки кишечника кур. 6.Детализация воспалительного фона и направленности иммунного ответа в тонком и толстом отделах кишечника кур путем количественного определения экспрессии генов цитокинов ИЛ-1β, ИЛ-2, ИНФ-γ, ИЛ-10. 7. Оценка нарастания общего пула секреторного IgA и sIgA+ клеток в тонком и толстом отделах кишечника кур. 8.Создание биологической модели эймериоза кур для оценки эффективности исследуемых вакцин.
Научная новизна. Впервые в сравнительном аспекте оценена эффективность и поствакцинальные реакции вакцины против эймериоза кур нового поколения «Эвалон» (Hipra Lab., Испания) на основе живых ооцист эймерий E. acervulina, E. tenella, E. maxima, E. necatrix и E. brunetti с мукозальным адъювантом Montanide™, предназначенным для стимуляции локального иммунитета слизистых кишечника, и вакцины, традиционно используемой в хозяйствах России - «Ливакокс Q» (Biopharm, Чешская республика), содержащей живые ооцисты эймерий E. acervulina, E. tenella, E. maxima и E. necatrix. Впервые в России оценены патологоанатомические, гистоморфологические и гистоморфометрические данные поствакцинальных изменений слизистой оболочки кишечника кур под действием живых эймерий, в результате формирования иммунного ответа, а также их информативная значимость. Получены новые данные по экспрессии генов цитокинов ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-10, ИНФ-γ в клетках слизистой оболочки кишечника методом ПЦР-РВ с целью оценки уровня воспалительного фона, необходимого для активации адаптивного специфического иммунитета и прогноза направленности иммунитета, формирующегося в ответ на вакцинацию исследуемыми вакцинами. Разработан метод, позволяющий оценить общий пул секреторного IgA и содержания клеток-продуцентов секреторного IgA в слизистой оболочке кишечника кур, с помощью иммуногистохимической реакции. Получены новые данные, касающиеся экспериментального заражения племенной птицы, вакцинированной аттенуированными вакцинами против эймериоза «Эвалон» и «Ливакокс Q» в возрасте 16 недель с целью оценки длительности и напряженности поствакцинального иммунитета на фоне умеренной иммуносупрессии.
Теоретическая и практическая значимость. Предложена комплексная оценка поствакцинальных процессов, определяющих эффективность аттенуированных вакцин «Ливакокс Q» и «Эвалон». Получены новые данные о патологоанатомических, гистоморфологических и гистоморфометрических изменениях, позволяющих оценить воспалительный фон и функциональное состояние слизистой оболочки кишечника кур после вакцинации против эймериоза. Получена новая информация, касающаяся экспрессии генов цитокинов ИЛ-1β, ИЛ-2, ИНФ-γ и ИЛ-10 кур и их функций в слизистой оболочке кишечника методом количественной ПЦР с реакцией обратной транскрипции. Получены данные по динамике накопления плазмоцитов, секретирующих IgA и общему пулу sIgA в секрете слизистых оболочек кишечника с помощью иммуногистохимического метода с использованием моноклональных антител к sIgA кур (Southern Biotechnology, США). Оценена иммуногенность аттенуированных вакцин «Ливакокс Q» и «Эвалон» путем экспериментального заражения кур Хайсекс Браун на 16 неделе после вакцинации на фоне иммуносупрессии, что представляет теоретический интерес для профилактики эймериоза кур у племенной птицы. Полученные данные поствакцинальных изменений в организме кур позволяют оценить баланс между безопасностью вакцин и их иммуногенностью, и позволят ветеринарным врачам планировать возможное проведение патогенетической терапии после вакцинации кур против эймериоза, направленную на минимизацию экономических затрат при возникновении нарушений пищеварения, развития бактериозов и увеличения конверсии корма. Предложены методические положения «Современные методы оценки мукозального иммунного ответа кур после вакцинации против эймериоза», утвержденные руководителем секции зоотехнии и ветеринарии отделения сельскохозяйственных наук РАН, академиком РАН Калашниковым В.В. Подана заявка на патент «Методы оценки локального иммунного ответа после вакцинации против эймериоза кур путем выявления секреторного иммуноглобулина класса А в слизистой оболочке кишечника с помощью иммуногистохимического исследования срезов замороженного материала». Номер заявки 2018120640, дата приоритета 04.06.2018. Использованная в диссертации гистоморфометрическая оценка слизистой оболочки различных отделов кишечника кур может быть использована в научных целях при дальнейшем изучении локального иммунитета кишечника кур и воздействия патогенов на состояние его слизистой. Материалы диссертации могут быть использованы в учебном процессе на кафедрах паразитологии и ветеринарно-санитарной экспертизы, эпизоотологии и микробиологии, иммунологии и биотехнологии, а также при написании соответствующих разделов учебников, учебных пособий и монографий.
Методология и методы исследований. При выполнении работы были применены методы зоотехнической оценки продуктивности птицы: взвешивание, оценка потребления и конверсии корма; паразитологические методы исследования: флотационный метод Фюллеборна, подсчет инвазионных элементов в камерах МакМастера и Горяева, изоляция, концентрирование и накопление ооцист эймерий из помета; патологоанатомические и патоморфологические методы исследования: гистоморфология и гистоморфометрия сегментов кишечника птицы; иммунологический метод: иммуногистохимическое исследование; молекулярно-генетический метод: ПЦР; биологический метод: экспериментальное заражение; применены методы научного познания: наблюдение, интерпретация, обобщение.
Степень достоверности исследований. Достоверность результатов подтверждается большим объемом патологоанатомических, гистоморфологических, гистоморфометрических, иммунологических, молекулярно-биологических исследований материала. Результаты работы определяются достаточным количеством проведенных исследований на животных. Экспериментальные исследования проведены автором по общепринятым методикам и обработаны методом статистического анализа c помощью программного обеспечения STATISTICA и Microsoft Excel 2016.
Соответствие представленной работы паспорту специальности 03.02.11. Диссертационная работа соответствует паспорту специальности 03.02.11. – паразитология и содержит материалы исследований в следующих областях: изучение взаимоотношений в системе: хозяин – паразит (иммунология, патология, иммуногенетика хозяев); изучение клиники болезней животных, возникающей вследствие поселения паразитов в их органах, тканях и полостях; изыскание наиболее эффективных мер борьбы и профилактики паразитарных болезней животных.
Апробация работы. Материалы по результатам исследований диссертации представлены на Международной научно-практической конференции, посвященной 95-летию со дня основания кафедры паразитологии и ветеринарно-санитарной экспертизы МГАВМиБ им. К.И. Скрябина (Москва, 2015); I, II этапах Всероссийского конкурса на лучшую научную работу среди студентов, аспирантов и молодых ученых высших учебных заведений Минсельхоза России (Москва, Иваново, 2016); III Международном научно-практическом симпозиуме «Инновации в области повышения сохранности, кормления и технологии выращивания птицы» (Черногория, 2016); IV Международном научно-практическом симпозиуме «Инновации в области повышения сохранности, кормления и технологии выращивания птицы» (Кипр, 2017); II Международном паразитологическом симпозиуме (Санкт-Петербург, 2017); V Международном научно-практическом симпозиуме «Инновации в области повышения сохранности, кормления и технологии выращивания птицы» (Турция, 2018); Международной конференции «Диагностика и профилактика болезней птиц в промышленном птицеводстве» (Москва, 2019); 6 Международной конференции по вопросам здоровья кишечника птицы «IHSIG» (Рим, 2019); 4 Международный симпозиум по паразитарным заболеваниям птицы (Вена, 2019).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 2 статьи в научно-практических журналах, 6 статей в сборниках научных трудов, 1 методическое положение.
Личный вклад автора. Основной объем диссертационной работы проведен автором самостоятельно и включал в себя анализ отечественной и зарубежной литературы, планирование исследований, экспериментальная часть работы, анализ полученных данных и формулирование выводов. По данным системы «Антиплагиат» степень оригинальности работы составляет 84,88%. В выполнении отдельных этапов работы принимали участие сотрудникам ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко РАН Стаффорд В. В. и Надточий (интерпретация результатов гистологических и иммуногистохимических исследований), а также сотрудники ФГБУ ГНЦ Института иммунологии ФМБА России Шиловский И.П. и Камышников О.Ю. (консультации по ПЦР), которым выражаю глубокую благодарность за помощь и поддержку.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 191 страницах компьютерного набора и содержит следующие разделы: список сокращений и условных обозначений, введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, состоящие из глав материалы и методы и результаты исследований, обсуждение результатов исследования, заключение и список используемой литературы (141 источник, из которых 106 зарубежных авторов). Работа иллюстрирована 48 рисунками, 15 таблицами и включает 10 страниц приложений.