Автореферат (Влияние латентной вирусной инфекции на течение и прогноз рака мочевого пузыря), страница 3

ПЦР соскоба изуретры, мочи и опухоли проводилась по стандартной методике с определениемДНК вирусов ВПГ 1 и 2-ого типов, ЦМВ, ВЭБ, ВПЧ высокого онкогенногориска.Определение вирусных ДНК выполнено методом ПЦР с гибридизационнофлуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

Исследованиепроводилось полуавтоматическим способом с использованием ПЦР-детекторовCFX-96, Bio-Rad/США и реактивов Вектор-Бест (Россия), верхний пределопределения (с разведением) – 100 копий в пробе.Морфологическая оценка препаратов производилась по следующейметодике. Операционный материал фиксировался в 1% р-ре нейтральногоформалина и заливался в парафин.

Срезы толщиной 5 мкм, окрашенныегематоксилином-эозином, были подвергнуты обзорному морфологическомуанализу,прикоторомстадиюракаопределяливсоответствиисклассификацией TNM, а степень дифференцировки опухолевых клетокоцениваливсоответствииМикроскопическоеизучениесрекомендациямипрепаратовВОЗпроводилосьотс1973года.применениембинокулярного микроскопа с фотоприставкой Axio Zeis при 400-кратномувеличении.Оценка воспалительной инфильтрации в опухолевой ткани и подлежащейстроме производилась по следующей методике: полуколичественно от 0 до 3баллов (отсутствие, слабая, умеренная и выраженная степень) оценивалосьсостояние лимфоцитарно-плазмоцитарного инфильтрата: а) в опухоли, б)рассеянного в подлежащей строме, в) периваскулярная инфильтрация, г)очаговая гиперплазия лимфоидной ткани в виде лимфоидных фолликулов.13Иммуногистохимическоеисследованиепроводилосьнасерийныхпарафиновых срезах 5 мкм, используя стрептавидин-биотиновый метод.

Вкачестве детекционной системы использовалось 6 маркеров. Определялисьследующие показатели: маркер пролиферативной активности Ki67 (sp6), маркерсупрессора опухолевого роста Bcl-2 (D07), p53 (124), маркер ангиогенеза CD31(sp164), маркер адгезии CD44 (spm521), ростовой фактор EGFR (sp84) (SpringBioscience).Интенсивность реакций с антигенами, локализованными на мембранахклеток и внутриклеточных мембранах (CD44, CD31, EFGR и Bcl-2),оценивалась полуколичественным способом по бальной шкале от 0 до 3,учитывая выраженность реакции и ее локализацию: 0 - отсутствие реакции, 1 слабая реакция, 2 - умеренная реакция, 3 - сильная реакция.

Результаты реакциис антигенами, имеющими ядерную локализацию (Кi67, р63), оценивались посистеме подсчета histochemical score, включающей в себя интенсивностьиммуногистохимической окраски по 3-балльной шкале и долю (%) окрашенныхклеток, и представляющей сумму произведений процентов, отражающих долюклеток с различной интенсивностью окраски на балл, соответствующийинтенсивности реакции.

Интенсивность окраски: 0 - нет окрашивания, 1 слабое окрашивание, 2 - умеренное окрашивание, 3 - сильное окрашивание.ОпределениеLMP-1.Десятипациентам,укоторыхприиммунологическом обследовании выявлен вирус Эпштейна-Барр в опухолиметодом ПЦР, было выполнено иммуногистохимическое исследование впарафиновых срезах на наличие ДНК вируса в ядрах опухоли с помощьюмоноклональных мышиных антител к ВЭБ/Epstein-Barr Virus/ LMP Ab-1, клонCS1+CS2+CS3+CS4(производствоThermoFisherScientific).Результатоценивали по наличию или отсутствию экспрессии к антигену LMP Ab-1вируса Эпштейна-Барр в парафиновых срезах опухоли мочевого пузыря.Определение экспрессии PD-L1. Десяти больным с наличием вирусныхДНК в ткани опухоли и 10 больным с наличием морфологических признаковВЭБ, ЦМВ, ВПЧ-инфекции была определена экспрессия PD-L1 как в14опухолевых клетках, так и в лимфоидном инфильтрате.

Использована системадетекции: OptiView DAB IHC Detection Kit и OptiView Amplification Kit (Roche,Ventana). Исследование произведено на иммуностейнере Ventana ULTRA(Roche). Результат исследования опухолевой ткани: мембранная экспрессия вопухолевых клетках, выраженная в процентах. Результаты исследованиялимфоидной инфильтрации стромы опухоли - наличие лимфоцитов в стромеопухоли, выраженное в процентах. Положительной реакцией считалосьналичие экспрессии PD-L1 в иммунных клетках и клетках опухоли более 1%.Методы статистической обработкиСтатистическая обработка данных выполнена на индивидуальномкомпьютере с помощью электронных таблиц «Microsoft Excel» и пакетаприкладных программ «Statistica for Windows» v. 8.0, StatSoft Inc.

(США) и«SPSS for Windows» v.17.0. Всеполученныеколичественныеданныеобработаны методом вариационной статистики. Для каждого количественногопараметра были определены: среднее значение (M), среднеквадратическоеотклонение (SD), ошибка среднего (m), медиана (Me), интерквартильныйразмах (Q1-Q2), 95% доверительный интервал. Для качественных данныхопределяли показатели частоты (%).Для сравнения числовых данных (после проверки количественныхданных на нормальное распределение) использовали метод дисперсионногоанализа ANOVA (для нескольких групп) и t-критерий Стьюдента для двухнезависимых выборок.

При отсутствии нормального распределения данныхприменялись методы непараметрической статистики – U-тест Манна-Уитни.При нормальном виде распределения данных для оценки различий в группахприменялись методы параметрической статистики (t-критерий Стьюдента).При оценке качественных признаков использовался критерий χ2 Пирсона.В случае, если абсолютные частоты в клетках таблицы сопряженности былименее 10, использовали поправку Йетса на непрерывность. При условии, когдаобъем выборки не превышал 5 случаев, использовали точный критерий Фишера15для небольших выборок.

При невозможности применения критерия Хи-квадрат(все ожидаемые числа >5) использовался t-критерий Стьюдента, а для 0% и100% применялась поправка для концевых точек.Статистически значимыми считались различия при р<0,05 (95%-йуровень значимости). Связь между изучаемыми показателями оценивалась порезультатамкорреляционногоанализасвычислениемкоэффициентакорреляции Пирсона (r) или Спирмена (R) и последующим установлением егозначимости по критерию t.Отношениешансов(ОR)заболеваемостивычисляли по методу Woolf. Статистическую достоверность отличия ОР от 1(р)определяличетырехполосныхпоточномутаблицсдвустороннемупоправкойнакритериюколичествоФишерадлявыявленныхаллелей/генотипов (рс).

Относительный риск (RR) заболеваемости вычислялипо методу Katz. В том случае, когда один из показателей был равен 0,относительный риск вычисляли по формуле, модифицированной Haldane длямалых чисел.Применялся ROC (Receiver Operator Characteristic) анализ для выявленияпоказателей уровня противовирусных антител в качестве прогностическогофактора. Для этого вычисляли параметр – площадь под кривой (AUC) дляопределения качества модели. Качество модели в зависимости от AUC(площадь под кривой): 0,9-1,0 – отличное; 0,8-0,9 – очень хорошее; 0,7-0,8 –хорошее; 0,6-0,7 – среднее; до 0,6 – неудовлетворительное.Сцельюопределенияпрогностическойзначимостиуровняпротивовирусных антител в развитии рецидива рака мочевого пузыря вкачестве статистического анализа использовались деревья классификации(дерево решений – CHAID). Это метод, позволяющий предсказыватьпринадлежность наблюдений или объектов к тому или иному классукатегориальной зависимой переменной в зависимости от соответствующихзначений одной или нескольких предикторных переменных.

Цель построениядеревьев классификации заключается в предсказании (или объяснении)значений категориальной зависимой переменной.16Для исследования влияния нескольких независимых переменных на однузависимую переменную использовался одномерный дискриминантный анализ— метод бинарной логистической регрессии.ПроведенвсоответствиисГОСТР7.0.5-2008«Патентныеисследования». Тема охраноспособна.Основные положения, выносимые на защиту1. Доказана высокая частота наличия хронических герпес-вирусныхинфекций (ВЭБ, ЦМВ) у больных раком мочевого пузыря, чтоподтверждено высокими титрами противовирусных антител, особенно убольных с рецидивными формами опухолевого процесса.

Присутствиевирусных ДНК в ткани опухоли определяется у трети больных и чащевсего обусловлено наличием ДНК ВЭБ. Определяются коррелятивныесвязи между уровнем противовирусных антител и ДНК ВЭБ, ЦМВ,рецидивным характером опухолевого роста, что свидетельствует оналичии сочетанной инфекции и потенцировании свойств одних вирусовдругими. Возможный онкомодулирующий эффект ЦМВ подтвержденповышением титров антител к ЦМВ по мере нарастания стадиизаболевания, степени анаплазии и рецидивным характером опухолевогороста.2. Морфологическиеассоциированныеособенностисхроническойопухолейгерпес-мочевогоипузыря,папилломавируснойинфекцией, характеризуются как наличием, так и количественнымувеличениемсоставляющихлимфоцитарно-плазмоцитарногоинфильтрата (периваскулярной инфильтрации, очаговой гиперплазиилимфоидной ткани, наличием лимфоцитов как в подлежащей строме, таки в опухоли), цитопатическими изменениями. Принципиальной являетсястепеньвыраженностиуказанныхизменений.Данныеизменениясвидетельствуют о неблагоприятном течении опухолевого процесса, так17как ассоциированы с повышением стадии процесса и степени анаплазии,некоторые из них – с маркерами ангиогенеза и пролиферации.3.

Доказана способность опухолевых клеток на фоне латентной вируснойинфекцииуклонятьсяотиммунногоответа,чтоподтвержденоповышением экспрессии PD-L1 у пациентов как с наличием вирусныхДНК в ткани опухоли, так и наличием морфологических признаковгерпес- и папилломавирусных инфекций.4. Неблагоприятное влияние латентной вирусной инфекции обусловленоповышением пролиферативной активности опухоли, влияния на факторыапоптоза, ангиогенеза, факторы роста и метастатический потенциалопухоли у пациентов с наличием вирусных ДНК в ткани опухоли(особенно при сочетанной инфекции), что подтверждено даннымииммуногистохимических исследований.Достоверность и обоснованность результатов исследования.Доказательная база основана на результатах обследования и лечения 526пациентов, из которых 145 больным, страдающих раком мочевого пузыря,произведено комплексное исследование с использованием молекулярных,иммуногистохимических и иммуноферментных методов диагностики; 356пациентам группы ретроспективного анализа проведено комплексное лечениепо поводу рака мочевого пузыря в период с 2010 по 2014гг.