Автореферат (Блокаторы медленных кальциевых каналов новые возможности использования в качестве регуляторов образования соединительной ткани), страница 6

Следствием активации макрофагов примоделировании асептического воспаления брюшины являлась усиленная секреция имипровоспалительныхцитокиновTNF-иIL-1.Наиболеевыраженныеотклонениярегистрировались при определении количества TNF-, которое превышало значения в культуренеактивированных клеток в 19 раз (321,3±21,1 пг/мл против 17,1±1,8 пг/мл, р<0,05). Наряду сусилением выработки TNF-, в культуре активированных клеток наблюдалось изменениеуровня IL-1, которое достигало 3,6- кратного увеличения (54,4±4,2 пг/мл против 14,9±2,1 пг/млнеактивированных клеток, р<0,05).

Высокий уровень IL-1 и TNF-a активировал фактортранскрипции NF-κB. В ядерных лизатах культур клеток, полученных от крыс сгемоперитонеумом, показатели активации фактора транскрипции NF-κB (р50/р65) были в 8 развыше, чем в культуре неактивированных клеток (671,7±21,3 пг/мл против 84,2±27,6 пг/мл,р<0,0001), что является одним из объяснений избыточного роста соединительной ткани приспайкообразовании в результате блокирования апоптоза.

Между количеством IL-1 и NF-κB,TNF-a и NF-κB, NF-κB и числом спаек выявлена сильная положительная корреляционная связьс коэффициентами корреляции 0,78 - 0,81 (p<0,05).Такимобразом,выявленноенамиувеличениеколичестваактивированныхфибробластов, обладающих высоким пролиферативным потенциалом с морфологическимипризнаками митозов игиперэкспрессией Ki-67, усиление синтеза основных компонентовмежклеточного матрикса соединительной ткани коллагена и гиалуроновой кислоты,избыточная активность макрофагов с увеличением продукции провоспалительных цитокинов22TNF-, IL-1, активацияявляютсяключевымифактора транскрипции NF-κB с блокированием апоптоза клетокзвеньямиизбыточногоформированиясоединительнойткани,обусловливающего спайкообразование при гемоперитонеуме. Полученные равнозначныеморфологические эквиваленты формирования спаечного процесса в брюшной полости разныхвидов лабораторных животных с регистрацией усиленной функциональной активностифибробластов и макрофагов и ее связи с формированием спаек свидетельствуют обуниверсальности и адекватности созданной модели спайкообразования для изучениямеханизмов формирования внутрибрюшинных спаек, проведения фармакодинамическихисследований.На втором этапе экспериментальных исследований мы оценивали дозозависимоевлияния БМКК (верапамила, дилтиазема, нифедипина) на активированные фибробласты имакрофаги крыс с гемоперитонеумом с использованием клеточных технологий.

Введениеверапамила в культуру клеток в концентрациях 0,00005 мл-1 и 0,0001 мл-1 предотвращалочрезмерную активацию фибробластов (таблица 1). Митотическая активность клеток приуказанных концентрациях верапамила снизилась на 33,3% и 58,5% от уровня контроля культур без добавления лекарственных средств; количество Ki-67+ клеток уменьшилось на39,0% и 59,2%. Верапамил, введенныйв культуру перитониальных клеток, уменьшалгиперпродукцию коллагена активированными фибробластами. Количество белковосвязанногооксипролина, синтезируемого фибробластами в культуральной жидкости с верапамилом былона 66,7% ниже, чем в культуре клеток без добавлении лекарственных средств.

В присутствииверапамила в культуральной среде количество гиалуроновой кислоты также было ниже, чем вконтроле. Верапамил останавливал наработку гиалуроновой кислоты на уровне61,3% отпоказателей контроля. Степень снижения уровней данных веществ была более значима приконцентрации препарата 0,0001 мл-1 (таблица 1).Дозозависимый эффект действия верапамила был обнаружен имоноцитов-макрофагов.Активированныеперитонеальныемоноцитыпри исследованиидемонстрироваливысокую способность к трансформации в макрофаги (таблица 1). Показатели макрофагальнойтрансформации моноцитов в культуре клеток с верапамилом были ниже, чем в контроле. Болеезначимое торможение чрезмерной пролиферации моноцитов прослеживалось в концентрации0,0001 мл-1.

Исследование уровней TNF- и IL-1 выявило снижение их синтеза под действиемверапамила. Введение в культуру клеток верапамила в концентрации 0,00005 мл-1предотвращало повышение наработки активированными макрофагами данных цитокинов науровне менее значимом, чем при использовании большей (0,0001 мл-1) концентрации вещества(таблица 1).23Таблица 1. Влияние верапамила на морфофункциональные показатели перитонеальныхфибробластов и макрофагов (M±m)ПоказателиКонтрольВерапамил (конц.)0,00005 мл-10,0001 мл-18,2±0,3*5,1±0,1*^19,9±0,4*13,3±0,6*^26,7±1,712,6±0,9*8,9±0,2*^1,6±0,121,2±0,1*0,98±0,05*МТМ, %60,5±3,148,1±1,7*36,2±2,6*^TNF-, пг/мл321,3±21,1164,2±14,7*97,4±6,8*^IL-1, пг/мл54,4±4,240,1±1,7*27,1±2,6*^МИ фибробластов, %Количество12,3±0,4Ki-67+ 32,6±0,7*клеток, %Оксипролин,мкмоль/лГиалуроноваякислота, ммоль/лПримечание: * - достоверность различий между показателями перитонеальных фибробластов имакрофагов в культуре клеток с добавлением верапамила и контролем,^ - междуконцентрациями препарата, p<0,05.Выявление наличия фармакологического эффекта удилтиазема в концентрациях0,00005 мл-1 и 0,0001 мл-1 в отношении перитонеальных фибробластов и макрофагов, оценкаего выраженности по сравнению с верапамилом показали, что дилтиазем, хотя и снижаетчрезмерную функциональную активность данных клеток соединительной ткани, но егонормализующее действие менее выражено, чем у верапамила (таблица 2).Таблица 2 Влияние дилтиазема на морфофункциональные показатели перитонеальныхфибробластов и макрофагов (M±m)ПоказателиКонтрольМИ фибробластов, %КоличествоДилтиазем (конц.)0,00005 мл-10,0001 мл-111,7±0,49,4±0,3*^27,2±0,9*17,5±0,5*^26,7±1,718,9±1,2*14,3±1,1*^1,6±0,121,5±0,11,28±0,06*12,3±0,4Ki-67+ 32,6±0,7*клеток, %Оксипролин,мкмоль/лГиалуроноваякислота, ммоль/л24МТМ, %60,5±3,156,5±4,347,3±2,9*TNF-, пг/мл321,3±21,1253,1±9,3*198,1±10,1*^IL-1, пг/мл54,4±4,247,2±2,139,8±2,3*^Примечание: * - достоверность различий между 6-й группой (дилтиазем), и контролем(4-я группа), ^ - между концентрациями, p<0,05.Прослеживалась зависимость эффекта от концентрации препарата.

Добавление ккультуральной среде дилтиазема в концентрации 0,0001 мл-1 приводило к статистическизначимому в сравнении с контролем снижению уровней митозов фибробластов, количества Ki67+ клеток, макрофагальной трансформации моноцитов, коллагена и гиалуроновой кислоты,TNF- и IL-1. При меньшей концентрации дилтиазема (0,00005 мл-1) достоверных различий сконтролем у 4 из 7 исследованных показателей не найдено (таблица 2).Нифедипин в концентрациях 0,00005 мл-1 и 0,0001 мл-1 не оказывал действия накультуру активированных фибробластов и макрофагов, не влиял на процессы пролиферацииклеток, количество оксипролина и гиалуроновой кислоты, уровни TNF- и IL-1.

Различиямежду изученными показателями в культурах клеток с добавлением нифедипина и без негобыли статистически недостоверны (таблица 3).Таблица3.Влияниенифедипинанаморфофункциональныепоказателиперитонеальных фибробластов (M±m)ПоказателиКонтрольНифедипин (конц.)0,00005 мл0,0001 мл-112,4±0,511,5±0,3-1МИ фибробластов, 12,3±0,4%Количество Ki-67+ 32,6±0,7клеток, %Оксипролин,26,7±1,7мкмоль/лГиалуроновая1,6±0,12кислота, ммоль/лМТМ, %60,5±3,131,9±1,330,1±1,925,9±2,923,1±0,51,6±0,11,48±0,0861,3±2,756,1±3,4TNF-, пг/мл321,3±21,1297,1±9,8271,2±14,2IL-1, пг/мл54,4±4,255,4±3,147,4±3,9Исследование не описанного ранее фармакологического действия БМКК на клеткисоединительной ткани показало, что верапамил и дилтиазем в концентрациях 0,00005 мл-1 и0,0001 мл-1 оказывали нормализирующее влияние на усиленную асептическим воспалением25брюшины пролиферативную активность и синтезирующую функцию фибробластов имакрофагов.Наиболее выраженный модулирующий эффект был выявлен при действииверапамила в концентрации 0,0001 мл-1.

В культурах клеток, инкубируемых с верапамилом,активность митотического процесса,экспрессии маркера пролиферации Ki-67cинтезбелковосвязанного оксипролина, гиалуроновой кислоты, TNF- и IL-1 уменьшались болеезначимо, чем с дилтиаземом. У нифедипина эффекта влияния на клетки соединительной тканивыявить не удалось.При анализе экспрессии транскрипционного фактора NF-kB (р50/р65) в первичнойкультуре перитонеальных фибробластов и макрофагов крыс с гемоперитонеумом выявило, чтоего высокая активность (671,7±21,3 пг/мл в культуре активированных клеток против 84,2±27,6пг/мл в культуре неактивированных клеток р<0,0001) при добавлении в инкубационную средураствора верапамила или дилтиазема снижалась, при добавлении нифедипина не менялась(таблица 4).

Введение верапамила в культуру клеток наиболее эффективно предотвращалочрезмерную активацию ядерного фактора транскрипции фибробластов: уровень NF-kB вядерных лизатах культур снизился при концентрации верапамила 0,00005 мл -1 на 15,8%(р<0,01), при концентрации 0,0001 мл-1 на 28,2% ( р<0,001).Таблица 4. Изменение содержания NF-kB (пг/мл) под влиянием БМКК в ядерныхэкстрактах перитонеальных фибробластов и макрофагов крысы (M±m).Показателиконцентрация0,00005 мл-10,0001 мл-1верапамил565,1±16,7**482,4±26,5***дилтиазем650,5±31,2^570,5±21,8**^нифедипин677,9±30,3^607,9±32,2^Контроль (без лекарственных средств) 671,7±21,3Примечание: * - достоверность различий с группой без введения лекарственных средств, * p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001.

^ - достоверность различий между группой с верапамилом идилтиаземом, верапамилом и нифедипином (p<0,05).Добавление дилтиазема в культуру перитонеальных клеток вызывало менее значимое, всравнении с верапамилом, уменьшение активности NF-kB. Его уровень был ниже значенийконтроля на 15,1% (р<0,01) только при концентрации дилтиазема 0,0001 мл-1, при меньшейконцентрации препарата показатели от контрольных значений не отличались (таблица 4).Сравнительный анализ уровней активированного NF-kB при добавлении в среду верапамила26или дилтеазема выявил достоверное различие показателей (p<0,05).