Диссертация (Получение и стандартизация эритроцитарных носителей, инкапсулированных терпено-индольными алкалоидными противоопухолевыми препаратами), страница 11

Такие эритроцитыназываются пост-гемолитическими плазменными мембранами эритроцитов“erythrocytes ghost”.Для непрерывного или пролонгированного высвобождения лекарств, эритро-циты могут быть использованы в виде непрерывной или пролонгированной системы высвобождения, которая обеспечивает пролонгированное действие. Существуют различные методы для инкапсуляции лекарственных средств в эритроциты. Они остаются в циркулирующем кровотоке на длительные периодывремени (до 120 дней) и высвобождают захваченные лекарственные вещества смедленной и постоянной скоростью.Целенаправленная доставка «Таргетинг» ЛС к РЭС (макрофаги, печеночные клетки Купфера, альвеолярные макрофаги легкого, моноциты периферической крови и сосудистые эндотелиальные клетки) или другим органам, или тканям путем различных манупуляций (внешного магнитного поля, ультразвука идр.) [115; 251] - еще одна важная стратегия, использующая эритроциты в качестве носителей [33; 80].

Значительная часть эритроцитов-носителей, которыеподверглись некоторым структурным изменениям в процессе инкапсуляции, будет задерживаться органами РЭС, главным образом, печенью и селезенкой в течение короткого периода времени после введения в организм. Следовательно,часть инкапсулированного препарата быстро истощается в РЭС. Эта стратегия60подходит для лечения конкретных болезненных состояний, в том числе, в случаепеченочных опухолей и метастаз.Преимущества и недостатки эритроцитов как клеточных носителей (КН).К преимуществами КН относятся [33; 129; 183]: Высокая степень биосовместимости, особенно, когда аутологичные клетки используются для инкапсулирования ЛС в качестве носителя, и в результате полной биоразлагаемости КН отсутствуют токсичные продукты [204]; Препараты, инкапсулированные в эритроцитах, не проявляют фармакологические и токсикологические эффекты, пока не достигнут РЭС, что значительноуменьшает появление частоты побочных действий.

Это значимо в случае применения препаратов с выраженной токсичностью, таких как противоопухолевые,аминогликозидные антибиотики и др.; Малая вероятность появления нежелательных иммунных реакций против инкапсулированных препаратов; При инкапсулировании антинеопластических средств в КН (эритроциты) организм существенно зашищен от нежелательных эффектов этих препаратов; Возможность пролонгиравания действия препаратов, так как КН (эритроциты)могут циркулировать в кровотоке долгое время; КН осуществляют зашиту инкапсулированных лекарственных средств отинактивации под действием эндогенных факторов; Возможность модификации фармакокинетических и фармакодинамическихпараметров препарата; Возможность поддержания постоянной терапевтической дозы на протяжениидлительного периода, значительное увеличение интервала дозирования препарата; Возможность инкапсулирования относительно большого количества препарата в малые объемы эритроцитов.61К недостаткам КН относятся: Основная проблема, возникающая при использовании биоразлагаемых материалов или натуральных клеток, как переносчиков лекарства, заключается в том,что они элиминируются в естественных условиях по РЭС, в результате изменения структуры КН.

Но этот недостаток можно устранить при помощи инкапсулированной технологии; Возможно быстрое высвобождение инкапсулированных ЛС. Но этот недостаток можно устранить при помощи различных линкеров; Необходимость специальных условий для сохранения инкапсулированныхКН.При использованиях эритроцитов в качестве носителя для ЛС, нужно уделять внимание некоторым факторам, таким как: возможность эритроцитов пройти через капилляры патологического очага, возможность целенаправленной доставки, возможность улучшения биосовместимости и минимализация токсичности инкапсулированного препарата, возможность минимализировать потерю инкапсулированного лекарственного средства до достижения целевого места, возможность высвобождения инкапсулированного препарата с постоянной скоростью или контролируемым высвобождением.Первые попытки по загрузке химических веществ в эритроцитах были сделаны в 1953 году Гардосом, который пытался загрузить АТФ в «постгемолитические плазменные мембраны эритроцитов, так называемые «Эритроцитарные Тени - erythrocyte ghosts» [9].

В 1959 году Марсден и Остлинг сообщило помещении декстрана с молекулярной массой от 10 до 250 KD в постгемолитические плазменные мембраны эритроцита (ПГПМЭ) [152]. Четырнадцать лет спустя, Garret M. Ihler et al. успешно инкапсулировал β-глюкозидазу иβ-галактозидазу в эритроцитах, а также Zimmermann et al.

в 1973 г. впервыеопубликовали отчеты о загрузке терапевтических агентов в ПГПМЭ в целях доставки. Термин эритроцитарные носители был использован в первый раз в 1979году, чтобы описать препараты, которые загружали в эритроциты [55; 118].62Elena Zocchi et al. провели исследования на печени, направляя эритроциты,инкапсулированные доксорубицином (ДОКс), для установления возможностиповышения терапевтического индекса препарата на мышиной метастатическоймодели [85]. Исследование было предпринято, чтобы определить, является липечень и легкие таргетингом препарата, может ли привести к увеличению противоопухолевой активности против метастазов, локализованных в этих органах.При инкапсулировании доксорубицина в эритроцитах, они применяли метод гипотонического диализа, а для высвобождения ДОКс применили изотоническийметод высвобождения.

При проведении экспериментов Elena Zocchi et al. обнаружили что, доксорубицин, инкапсулированный в эритроциты с помощью глютаральдегида, при внутривенном введение препарата существенно повышает печеночное и лёгочное поглощение у мышей. В результате этой процедуры доказано, что возможно концентрирование в печени препарата до 70% от введеннойдозы, по сравнению с 6%, когда вводился свободный препарат.

Легочное поглощение также увеличилось с 1% до 6% от введенной дозы.Генинг Т.П. в своем автореферате «эритроциты млекопитающих в направленном транспорте биологически активных веществ» отмечает, что органоспецифичность клеточных носителей, полученных из форменных элементов крови,непокрытых соответствующими антителами к органу мишени, будет определяться в первую очередь свойствами форменных элементов, способностью лейкоцитов мигрировать в очаг воспаления, эритроцитов фиксироваться эритрофагоцитирующими клетками, в основном печени и селезёнки, способностьютромбоцитов к адгезии на повреждённых участках (внутренний слой артерииили вены) сосуда [11].1.5.3. Основные методы инкапсулирования лекарственных веществ в эритроцитахДля инкапсулирования лекарственных веществ или других биологическиактивных соединений применяются различные методы.

В их числе: физические(метод электрического импульса), химические (химическая пертурбация эритро63цитов или мембран) и осмотические методы (гипотонический гемолиз, гипотоническое разведение, гипотонический лизис предварительного набухания и др.)(рис.1.7) [55; 80; 85; 137; 148].Рис. 1.7. Методы включения (инкапсулирования) лекарственных веществ в эритроциты*- изображение подготовлено на основе информации из источников [55; 76; 80; 148;200]1.5.3.1. Метод гипотонического лизисаСамым распространенным из перечисленных методов - это метод гипотонического лизиса [33; 55; 76; 80; 119; 148; 200].

Известны три вариации процедургипотонического лизиса: метод гипотонического разведения, метод предварительного набухания до выпуклости и метод диализа. Эти процедуры основаны нафизико-химических особенностях эритроцитов. Сам метод основан на способности эритроцитов к претерпеванию обратимого набухания в гипотоническом растворе.

Эритроциты имеют исключительную способность к обратимым изменениям формы с или без изменения объема и для обратимой деформации поднапряжением. Увеличение объема приводит к первоначальному изменениюформы от двояковыпуклой к сферической. Это изменение связано с отсутствиемизбыточной мембраны; следовательно, площадь поверхности клетки фиксирована. Клетки приобретают сферическую форму для размещения дополнительногообъема, сохраняя при этом постоянную площадь поверхности.

Прирост объемасоставляет ~ 25-50%. Клетки могут сохранять свою целостность вплоть до тону64са ~ 150 мOSM / кг, выше которой мембрана разрывается, высвобождая клеточное содержимое [119]. В этот момент (как раз перед лизисом клеток), некоторыепереходные поры 200-500 А0 генерируются на мембране. После лизиса клеток,клеточное содержание истощается. Остаток называется пост-гемолитическимиплазменными мембранами эритроцита. Через образовавшиеся поры, веществапоступают из внешней среды внутрь эритроцитов (рис.

1.8). При восстановлениитоничности раствора до исходного уровня, целостность поврежденной мембраныэритроцитов может восстанавливаться.Рис. 1.8. Основные этапы метода гипотонического лизиса эритроцитов*.а. эритроциты помещают в солевой раствор с пониженной ионной силой.b. Лизису предшествует набухание клеток до достижения критического объема и давления.При этом мембрана эритроцита лопается с образованием пор, которые в зависимости от условий могут иметь размеры от десятков ангстрем до 1,0-2,0 мкм.c. При восстановлении тоничности раствора до исходного уровня (0,9%) целостность поврежденной мембраны эритроцитов может восстанавливаться.*- изображение подготовлено на основе информации из источников [8; 55; 143]Гипотоническое разведение (Hypotonic dilution)Гипотоническое разведение было первым методом для инкапсуляции химических веществ в эритроциты [118] и является самым простым и быстрым.

Вэтом методе объем упакованного в эритроциты составляет от 2-20 единиц, кратных объемам водного раствора лекарственного средства. Тоничность растворавосстанавливается путем добавления гипертонического буфера. Полученнуюсмесь затем центрифугируют, супернатант отбрасывают и осадок промываютизотоническим буферным раствором [119; 148]. Основные недостатки этого метода включают низкую эффективность инкапсулирования препаратов (1-8%)[118] и значительную потерю гемоглобина и других компонентов клетки. Этот65метод является быстрым и простым, особенно для препаратов с низкой молекулярной массой. Гипотоническое разбавление используют для загрузки ферментов, таких как β-галактозидаза, β-глюкозидаза [118], аспарагиназа [149; 202; 252]и аргиназа, а также глюкокотрикоидов, таких как дексаметазон [202], бронхорасширяющего средства – сальбутамола.Eva Pitt et al.