Автореферат (Роль функциональных показателей сперматозоидов отца в программах предимплантационного генетического скрининга эмбрионов), страница 2

Уровеньфрагментации ДНК сперматозоидов устанавливался методом TUNEL. Для всех пар былопроведено экстракорпоральное оплодотворение методом ИКСИ с последующей биопсиейэмбрионов. Биопсированный генетический материал был подвергнут предимплантационномугенетическому скринингу с помощью сравнительной геномной гибридизации на чипах.Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программ «Statistica 6.0»и «R language» (R Core Team, 2015).Положения, выносимые на защиту1.

Функциональные показатели сперматозоидов отца оказывают значимое влияние нарезультаты предимплантационного генетического скрининга эмбрионов, полученных методомИКСИ.2. Уменьшение содержания морфологически нормальных сперматозоидов до уровня ниже4% приводит к увеличению частоты эмбрионов с численными аномалиями хромосом, а такжеделециями и дупликациями. Снижение концентрации сперматозоидов (менее 15 млн/мл)сопровождается повышением встречаемости эмбрионов с кариотипом 45, Х0.

Вместе с темподвижность сперматозоидов не влияет на результаты ПГС при проведении оплодотворенияметодом ИКСИ.3. Уровень фрагментации ДНК выше 15% ассоциирован с делециями и дупликациями вхромосомах эмбрионов, а также с увеличением частоты кариотипа 45, Х0.64. Проведение предимплантационного генетического скрининга эмбрионов при выявленииу мужчин патологии сперматозоидов позволит снизить как риск рождения ребенка сзаболеваниями, обусловленными изменением числа и структуры хромосом, так и вероятностьневынашивания беременности и самопроизвольного абортирования плода, связанных сналичием аномалий в кариотипе эмбриона.Степень достоверности. Достоверность результатов исследования подтверждаетсядостаточным объемом фактического материала (147 пар, 761 исследованный эмбрион),применением современных технологий и использованием методов статистической обработкиданных, полностью соответствующих поставленным задачам.Апробация результатов диссертации.

Материалы диссертации доложены на XXIIIмеждународной конференции РАРЧ «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» (г.Волгоград, 2013 г.), 32 Европейской конференции общества репродуктологов и эмбриологов(The 32th ESHRE, Финляндия, 2016 г.) и заседании кафедры биологии и общей генетикимедицинского института РУДН (2017 г.).Внедрение результатов в практику. Рекомендации для первичного обследованияэякулята мужчин на дополнительные параметры внедрены в практику ФГБУ «Научный центракушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И.

Кулакова» Министерстваздравоохранения России. Анализ фрагментации ДНК ядра сперматозоидов добавлен врекомендуемый список обследований перед вступлением пары в программу ЭКО/ИКСИ вОтделении Репродукции ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологииимени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения России.Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 6научных работ, из них 4 − в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Министерстваобразования и науки Российской Федерации для публикации результатов диссертационныхисследований.Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 110 страницахмашинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала иметодов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения исписка литературы.

Работа иллюстрирована 11 таблицами и 8 рисунками. Библиографиявключает 181 источник российской и зарубежной литературы.Личный вклад автора. Автором лично выполнялись манипуляции по получениюяйцеклеток и проведению оплодотворения методом ИКСИ; биопсия трофоэктодермыэмбрионов; анализ спермограммы и уровня фрагментации ДНК ядра сперматозоидов; анализ7полученных из медицинской документации анамнестических, клинических и лабораторныхданных пациентов; статистическая обработка и обобщение результатов исследования.Материал исследования.

В исследование были включены 147 пар, прошедшихпрограмму ИКСИ+ПГС и у которых было исследовано более 1 эмбриона.В рамках настоящей работы рассматривались 2 группы:1.Общая группа исследуемых (средний возраст женщин составил 34,4+6,6 года, мужчин -37,9+12,1 года), включавшая 147 пар.2.Группа репродуктивного возраста (средний возраст женщин составил 31,6+3,8 года,мужчин - 35,5+4,5 года), включавшая 93 пары.Каждая пара прошла полное обследование в соответствии с Приказом МЗ РФ №107н от30 августа 2012 г. «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий,противопоказаниях и ограничениях к их применению».

Проведение исследования былоодобрено этическим комитетом Федерального государственного бюджетного учреждения«Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова»Министерства здравоохранения Российской Федерации.В программе ЭКО была проведена стандартная стимуляция. Со 2-го дня менструальногоцикла и до дня введения триггера овуляции пациенткам вводили индивидуально подобраннуюдозу рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (пурегон/гонал) от 112,5 МЕ до200 МЕ в сутки.

В процессе стимуляции дозу корригировали в зависимости от ответа яичников.При достижении фолликулами диаметра 14 мм для предотвращения преждевременного пикасодержания лютеинизирующего гормона пациенткам вводился антагонист гонадотропинрилизинг-гормона (цетрореликс 0,25 мг). Триггер овуляции вводили при наличии в яичниках ≥3фолликулов диаметром ≥ 17 мм.

Трансвагинальная пункция яичников (ТВП) выполнялась через35-36 часов после введения триггера овуляции.Методы исследованияСтандартные методы исследования. Полное клинико-лабораторное обследование всоответствии с Приказом МЗ РФ№107н от 30 августа 2012 г. «О порядке использованиявспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к ихприменению».Определение концентрации, подвижности и морфологических характеристиксперматозоидовпроводилосьсиспользованиемавтоматическогоспермоанализатораВиодеоТест 2.1 (Россия). В качестве нормы рассматривались следующие параметры:концентрация – более 15 млн/мл, доля активно подвижных сперматозоидов – более 32%, долясперматозоидов с нормальной морфологией – более 4%.8Определение уровня фрагментации ДНК ядра сперматозоида осуществлялосьфлуоресцентным методом TUNEL с использованием набора реагентов АpopTagIn SituApoptosis Detection Kits (Мillipore, Бельгия).Экстракорпоральноеоплодотворениевыполнялосьспомощьюметодаинтрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (ИКСИ).Культивирование эмбрионов до 5-х суток развития.

Биопсия эмбрионов исследуемойпары осуществлялась методами микроскопической и манипуляционной микротехники.Метод сравнительной геномной гибридизации на чипах (СГГ) применялся дляпредимплатационого генетического скрининга эмбрионов. Исследование выполнялось сиспользованием оборудования фирмы Agilent (США). Полногеномную амплификацию ДНКисследуемых клеток проводили с помощью набора PicoPlex SingleCell WGA Kit (RubiconGenomics, США).

Мечение ампликонов осуществлялось с использованием набора SureTagDNA labeling Kit Agilent (США) согласно прилагаемой инструкции. Меченые ампликонынаносили на биочип Sure Print G3 8x60 KCGH Agilent (США), гибридизировали 16 часов,после чего проводили отмывку и сканирование на сканере биологических чипов SureScanMicroarrayScanner. Интерпретацию полученных результатов осуществляли с помощьюпрограммного продукта Agilent CytoGenomics 2.5.8.1.

В работе рассматривались только пары сколичеством диагностированных эмбрионов более 1.Статистическая обработка результатов исследования. Для сравнения средних вгруппах применяли модификацию t-теста Стьюдента для наблюдений с весами [Goldberg L. etal., 2005], реализованную в пакете «R language» [R Core Team, 2016]. В качестве весовиспользовали число биопсированных эмбрионов. Для подтверждения полученных результатовтакже применяли непараметрический критерий Манна-Уитни-Уилкоксона, рассчитанный спомощью программы Statistica 6.0.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ1.Концентрация сперматозоидовПри изучении ассоциации концентрации сперматозоидов с кариотипом получаемыхэмбрионов рассматривались 2 подгруппы: у мужчин одной подгруппы содержаниесперматозоидов было более 15 млн в одном миллилитре эякулята, что по современнымкритериям ВОЗ рассматривается в качестве нормы, а у мужчин другой подгруппы – менее 15млн/мл (патология).

Результаты, полученные в общей группе исследуемых, представлены втаблице 1.9Таблица 1. Частота (%) аномалий числа и структуры хромосом у эмбрионов в парах снормальной и патологической концентрацией сперматозоидов (общая группа исследуемых пар)Концентрациясперматозоидов в эякулятеМенее15 млн/мл(n=41)Кариотип эмбрионовБолее15 млн/мл(n=92)pt-тестрМУУтестНормальный47.3147.770.94490.6911Трисомии по аутосомам32.7133.820.84450.7908Моносомии по аутосомам32.1433.690.78870.6087Трисомиихромосомам3.275.110.33290.648316.3511.950.37080.6587пополовымДелеции и амплификацииКак видно из представленных данных, в сравниваемых подгруппах нормальныйкариотип наблюдается приблизительно у 47% эмбрионов.

Встречаемость численных аномалийаутосом, трисомий по половым хромосомам так же, как делеций и амплификаций, в данныхподгруппах достоверно не отличается.Аналогичные результаты были получены в группе репродуктивного возраста (табл. 2).Вместе с тем в группе репродуктивного возраста наблюдается выраженная тенденция кувеличению частоты эмбрионов с нормальным кариотипом, что особенно заметно в подгруппес нормальной концентрацией сперматозоидов. При этом снижается встречаемость численныханомалий аутосом.Выделение группы пациентов репродуктивного возраста обусловлено стремлениемминимизировать материнский эффект, так как в литературе можно найти множество работ, вкоторых связывают частоту анеуплоидий в эмбрионах и возраст матери [Verlinsky Y.

et al.,1997; Marquez C. et al., 2000; Kuliev A. et al., 2005; Munné S.. et al., 2005; Gianaroli L. et al., 2010;Nagaoka S.I. et al., 2012].10Таблица 2. Частота (%) аномалий числа и структуры хромосом у эмбрионов в парах снормальной и патологической концентрацией сперматозоидов (группа репродуктивноговозраста)Концентрациясперматозоидов в эякулятеМенее 15млн/мл(n=30)Кариотип эмбрионовБолее15 млн/мл(n=63)рМУУтестpt-тестНормальный53.4757.810.6170.8292Трисомии по аутосомам27.8524.360.61720.5578Моносомии по аутосомам23.8626.740.63790.5596Трисомиихромосомам3.744.610.74370.938519.1713.580.38590.5913пополовымДелеции и амплификацииОсобо следует отметить, что статистический анализ результатов предимплантационногогенетического скрининга эмбрионов все-таки выявил достоверные отличия между группамипарсолигозооспермиейинормозооспермией.Так,присниженииконцентрациисперматозоидов ниже нормы ВОЗ наблюдалось значимое повышение встречаемости эмбрионовс кариотипом 45, XO, фенотипически соответствующим синдрому Шерешевского-Тернера как вобщей группе исследуемых, так и в группе репродуктивного возраста, причем во втором случаеотличия более выражены (табл.