Автореферат (Создание новых комплексных ферментных препаратов грибных протеаз на основе штамма Penicillium canescens для эффективной конверсии белоксодержащего растительного сырья), страница 5

Максимальную эффективность при гидролизе ржи, тритикале и пшеницы проявил ФППЕП-Р – очевидно, за счет наличия у него как протеолитической, так и гемицеллюлазных видов19активности. По сравнению с контролем (без воздействия ферментов) применение ПЕП-Рпозволило увеличить выход водорастворимого белка на 29% (рожь, тритикале) и на 108%(пшеница); выход ВС увеличился на 111% и 125% на пшенице и тритикале, соответственно, ина 160% – на ржи. Менее эффективными были коммерческие ФП: по сравнению с контролемприменение ксиланазного ФП Палпфор-2 приводило к увеличению выхода водорастворимогобелка только на 10% (рожь, тритикале, пшеница); выход ВС увеличивался на 78 и 63% напшенице и тритикале, соответственно, и на 110% – на ржи. Протеазный ФП Acid Protease былболее эффективен, чем Палпфор-2, но все же проигрывал комплексному ФП ПЕП-Р:применение ФП Acid Protease приводило к увеличению выхода водорастворимого белкапримерно на 16% (рожь, тритикале) и на 92% на пшенице; выход ВС увеличивался на 89% и38% на пшенице и тритикале, соответственно, и на 120% – на ржи.Рисунок 8 – Выход водорастворимого белка (а) и восстанавливающих сахаров (б) приобработке различных видов зерна ФП: ПЕП-Р, Палпфор-2 и Acid Protease.К – контроль, без ФПУсловия гидролиза: 3 ч, 40°С, постоянное перемешивание, концентрация субстрата 50 г/л,дозировка – 6 мг ФП/г сырьяПри использовании пшеницы (сырья с относительно высоким содержанием белка) врезультате действия ПЕП-Р наиболее выраженным было увеличение выхода водорастворимогобелка за счёт проявления активности протеазы.

При использовании ржи (сырья с относительновысоким содержанием некрахмальных полисахаридов, НКП), использование ПЕП-Р приводилок существенному увеличению выхода ВС вследствие проявления активности комплексакарбогидраз.Таким образом, в опытах in vitro комплексный ФП ПЕП-Р, полученный на основе новогорекомбинантного штамма P. canescens Pep-4, обладающий как протеазной, так игемицеллюлазной активностями, эффективно гидролизовал белки и НКП зернового сырья,обеспечивая существенное увеличение выхода водорастворимых белка и сахаров. Наличие впрепарате протеолитической и гемицеллюлазных (в первую очередь – ксиланазной)активностей обусловливало более высокую эффективность использования ФП ПЕП-Р привоздействии на зерновое сырьё по сравнению с ФП, обладающих каким-либо одним видомактивности – только протеазной или только ксиланазной. Проведенные исследования in vitroпоказали целесообразность применения ФП ПЕП в качестве кормовой добавки прииспользовании кормов на основе зерновых культур.203.3.3 Результаты испытаний in vitro ферментных препаратов сериновой протеазыP.

canescens в качестве кормовой добавки на соевом сырьеДля оценки эффективности действия ФП сериновой протеазы были выбраны соевая мука(СМ) и соевый шрот (СШ), применяемые в кормопроизводстве как источники белка.Результаты действия ФП in vitro оценивали по образованию водорастворимого белка и ВС. Вкачестве ФП использовали Оризин (содержащий сериновую протеазу) и комплексный ФПМЭК, содержащий сериновую и кислую протеазу (таблица 8).Таблица 8 – Содержание белка (мг/г) и активности (ед./г) ферментных препаратов ПЕП-А,Оризин-А и МЭК-АПСКсА,БГЛрН 10,0, 40°СФПБелокрН 4,7, 30°СгемоглобинказеинатнатриярН 5,0, 50°СрН 5,0, 50°СПЕП-АОризин-АМЭК-А270±20300±201500±100-340±20730±604000±250170±10160±10ПЕП-А+Оризин-А всоотношении 1:1280±20870±60170±103140±220160±10В результате обработки СМ и СШ препаратами Оризин и МЭК, выход водорастворимогобелка относительно контроля увеличился в 2,4–2,6 раза, а ВС – в 45 и 32 раза, соответственно(рисунок 9).Рисунок 9 – Выход водорастворимого белка (а) и восстанавливающих сахаров (б) приобработке соевой муки (СМ) и соевого шрота (СШ) ФП Оризин и МЭК.

К – контроль, без ФПУсловия гидролиза: 3 ч, 40°С, постоянное перемешивание, концентрация субстрата 50 г/л,дозировка ФП – 6 мг ФП/г сырьяПрактически одинаковый выход водорастворимого белка при обработке СМ и СШ двумяФП, различающимися по составу (один имел в своём составе сериновую и кислую протеазы,другой – только сериновую), свидетельствует о том, что основным ферментом, гидролизующимсоевые белки, является сериновая протеаза, кислая же протеаза в этом процессе не участвует.Увеличение концентрации ВС при использовании ФП Оризин по сравнению с МЭКобусловлено более высокой активностью сериновой протеазы первого, и, следовательно, болееинтенсивному гидролизу белкового комплекса сои вследствие чего разрушаются углеводнопротеиновые связи, и, в конечном итоге, увеличивается выход ВС в раствор.Таким образом, полученные в опытах in vitro результаты показали эффективностьприменения ФП сериновой протеазы (на примере ФП Оризин-А и МЭК-А) при гидролизе21белков сои.

При этом было установлено, что наличие или отсутствие кислой протеазы в составеферментного комплекса не играет заметной роли с точки зрения влияния (в выбранных дляопытов in vitro условиях) на эффективность воздействия на белки сои. Очевидно, болеецелесообразно использовать комплекс сериновой и кислой протеаз (смесь ФП Оризин и ПЕП)на смешанном сырье, содержащем зерновое и бобовое сырьё.

Результаты исследованияэффективности применения ФП протеаз на смешанном сырье представлены ниже в опытах invivo.3.3.4 Результаты испытаний in vivo комплексных ферментных препаратов по влиянию напродуктивность и физиологическое состояние свиней при откормеПроведены испытания in vivo по влиянию полученных новых ФП на продуктивность ифизиологическое состояние свиней при откорме на племзаводе «Орловский» Тамбовскойобласти.

В опытах использовали промышленные ФП ПЕП и МЭК, полученные впроизводственных условиях на заводе ООО «Агрофермент». В таблице 9 приведеныхарактеристики используемых ФП.Таблица 9 – Содержание белка (мг/г) и активности (ед./г) ферментных препаратов ПЕП и МЭК,полученных в производственных условиях и использованных для испытаний по кормлениюсвинейПС по ФОЛП,ПС по HUTКсА,БГЛ,рН 10,5, 40°СФПБелокрН 4,7, 30°СрН 5,0,рН 5,0,ПЕП-П, гранулированный,на основе штаммаP.

canescens Pep-4Оризин-П, гранулированныйна основе штаммаP. canescens Oryzin-25МЭК-П(ПЕП+Оризин, в соотношении 1:1,5)гемоглобинказеин поГаммерстену50°С50°С65±4133000±6500-1080±50110±672±4-3400±150960±40220±1070±451000±20001020±50840±40160±8Для проведения опытов in vivo по принципу аналогов (порода, возраст, живая масса)было сформировано 4 группы молодняка свиней крупной белой породы; одна группа былаконтрольная и не получала ФП в составе корма, остальные три группы получали ФП (таблица10). Каждая группа состояла из 10 голов со средней живой массой поросят 55 кг на 1 голову.Продолжительность кормления составила 90 кормодней.

Все животные были обеспеченыодинаковыми условиями содержания.Таблица 10 – Схема откорма свиней (ОР – основной рацион)№ГруппаУсловия кормления1КонтрольнаяОР (контроль)234ОпытнаяОпытнаяОпытнаяОР +200 г/т ФП ПЕП-ПОР +500 г/т ФП ПЕП-ПОР +200 г/т МЭК-П22Основным рационом кормления животных был сухой комбикорм, следующего состава(% масс.): ячмень – 35, пшеница – 35, горох – 15, жмых подсолнечный – 12, фосфат кормовой –1, мел кормовой – 0,8, премикс – 1.

Кормление осуществлялось два раза в сутки по принятомуна ферме распорядку дня (потребление воды не ограничено).Включение в комбикорма ФП ПЕП-П и МЭК-П оказало положительно влияние напродуктивность, физиологические процессы, клиническое состояние животных, пищеварение,развитие внутренних органов и мясные качества откормочного молодняка свиней. А именно,при использовании ФП ПЕП-П в дозировке 200 и 500 г/т среднесуточные приросты живоймассы у свиней, по сравнению с контролем, увеличились на 44 и 61 г или на 7,2 и 10,0%,соответственно. При использовании МЭК-П в дозировке 200 г/т среднесуточный приростживой массы, по сравнению с контролем увеличился на 55 г или на 9,0%.

Показатели мяснойпродуктивности у свиней, получавших в рационах ФП, были выше контрольных по убойномувыходу туш на 0,6–1,2%. Все это свидетельствует о повышении усвояемости кормов уживотных, получавших в рационе ФП, за счет совместного действия комплекса протеаз игемицеллюлаз.По показателям рН, влагосвязывающей способности и интенсивности окраски мясасвинина опытных и контрольных групп имела признаки свинины, отвечающие стандартам NOR(Группа качества мяса – нормальное мясо или мясо с нормальной пищевой ценностью).

Анализхимического состава мяса и шпика подопытных животных показал высокую пищевуюценность. В мясе содержалось 4,00–4,27 % жира, 21,96–22,32 % белка, а в шпике 90,32–90,48 %жира и от 3,17 до 3,35 % белка. Эти показатели отвечают товарным и вкусовым качествам мясаи характеризуют высокую энергетическую ценность шпика.Расчёт экономической эффективности производства свинины с использованием новыхФП показал (в ценах 2016 г.), что при увеличении на 1 голову живой массы свиней от 55 до110–115 кг получен дополнительный доход в размере 488 рублей (дозировка ПЕП 200 г/т); 576рублей (дозировка ПЕП 500 г/т) и 628 рублей (дозировка МЭК 200 г/т).ЗАКЛЮЧЕНИЕ1.

Методами генной инженерии с использованием системы экспрессии генов на основештамма-реципиента P. canescens RN3-11-7 niaD- получены стабильные высокоактивныерекомбинантные продуценты грибных протеаз с различной специфичностью действия (безсущественного снижения базового уровня собственного комплекса гемицеллюлаз): P. canescensPep-4 – продуцент кислой аспартатной протеазы – пенициллопепсина; P. canescens RN3-11-7-7– продуцент пенициллопепсина и лейцинаминопептидазы; P.