Диссертация (Взаимоотношения геномной ДНК и липидов - влияние факторов окружающей среды), страница 6

В эукариотических клеткахсфинголипиды часто выступают как сигнальные молекулы, принимаяучастие в таких клеточных процессах, как пролиферация, миграция и апоптоз(Machesky et al., 2008). Наиболее изученным сфинголипидом являетсясфингозин (2S,3R,4E)-2-амино-4октадецен-1,3-диол) (Jimenez-Rojo et al.,2014). В млекопитающих обнаружены многие десятки структурныхвариантов сфингоидов, а в других эукариотах, бактериях и вирусахдополнительно‒многообразиенамногиесотнивозможностьтиповсфингоидов.образованияУвеличивэтоN-ацетилпроизводных(«церамидов»), а затем и на 500 фосфо- и глико-головных групп, получаемчисло отдельных представителей категории сфинголипидов в десятки тысячи более молекул (Merrill et al., 2009). Иногда образуются необычныепроизводные, такие как N-моно-, ди- или триметил-сфингоидные остовы31(включаяN,N-диметилсфингозин),3-кетодигидроцерамиды,N-ацетил-сфингоиды (С2 церамиды) или дигидроцерамиды (Zheng et al., 2006).

Хотяэти большие пулы данных сложны для понимания, привлечение подходов,основанных на геномных и липидомных исследованиях соответствующихметаболических путей, позволяет преодолеть эти сложности (Merrill et al.,2009). Коллектив авторов под руководством А.Х. Меррилл (A.H. Merrill, Jr.)(Shaneret2009)предлагаеткомплексметодовal.,сфинголипидовиспользовать(LCдляESI-MS/MS),исследованиясостоящийизвысокоэффективной жидкостной (для их разделения), и электроспрейионизацииитандемноймасс-спектрометрии(ESI-MS/MS)(дляихидентификации и количественного анализа) c использованием массспектрометров тройного квадруполя (QQQ, API 3000) и квадруполя с ионнойловушкой (API 4000 QTrap в режиме тройного квадруполя QQQ).

Последнийрежим отличается высокой чувствительностью, подобной эффективностиионизации, в отношении сфинголипидов с церамидным остовом посравнениюсосфинголипидамисдигидроцерамиднымостовомиспособностью идентифицировать сфингомиелины с церамидным остовом,используя псевдо-MS3-протокол. Cоединения, которые могут быть легкопроанализированы количественно с использованием в качестве внутреннегостандарта липидного коктейля, разработанного в рамках консорциума LIPIDMAPS,включают:основания,сфингоидные основанияцерамиды,дигексозил-церамиды1-фосфат-церамиды,итакиежеи1-фосфат-сфингоидныесфингомиелины,комплексныемоно-исфинголипидысдигидроцерамидным остовом (Shaner et al., 2009).

С помощью указанныхметодик c небольшой модификацией возможно идентифицировать такжеглюкозилцерамидысоответствующихигалактозилцерамиды.внутреннихстандартовмогутПридоступностибытьколичественнопроанализированы также и более сложные производные сфинголипидов,такие как сульфатиды. Модификация метода LC ESI-MS/MS может быть32использована для того, чтобы проанализировать большое число структурныхи сигнальных сфинголипидов с применением коммерчески доступныхвнутреннихстандартов.Данныйподходпроиллюстрированэтимколлективом авторов на примере сфинголипидома клеточной линиимакрофагов мыши RAW264.7 (Shaner et al., 2009).Липидомика, метаболизм липидов и вирусные заболеванияКоллектив авторов под руководством А.Х.

Меррилл (A.H. Merril, Jr.)изучил сфинголипидом клеток, инфицированных цитомегаловирусом (ЦМВ)человека (Machesky et al., 2008). Этот вирус использует различныесигнальные пути клетки, чтобы обеспечить собственную репликацию.Модулирует ли ЦМВ человека липидные сигнальные пути, это до недавнеговремени было неисследованной областью взаимодействий вирус ‒ клетка ‒хозяин. В указанной работе было исследовано накопление биоактивныхсфинголипидов и ферментов, ответственных за их биосинтез и деградацию.Обнаружено, что заражение ЦМВ приводит к накоплению сфингозинкиназы(SphK)‒фермента,синтезирующегосфингозин-1-фосфат(S1P)идигидросфингозин-1-фосфат (dhS1P). Исследование сфинголипидомногопрофиля инфицированных ЦМВ клеток показало увеличение уровня dhS1P ицерамида через 24 ч, что предполагает усиление синтеза сфинголипидов.Последующее уменьшение уровня dhS1P через 48 ч указывает на изменениеde novo синтеза сфинголипидов (Machesky et al., 2008).

Авторы доказали, чтосинтез сфинголипидов и сфингозинкиназная активность непосредственновлияют на рост и экспрессию генов ЦМВ человека. Эти результатыдемонстрируют, что пул сфинголипидов клетки‒хозяина динамическирегулируется цитомегаловирусом (Machesky et al., 2008).33Диабет, ожирение и липидомикаОжирение представляет собой мощный фактор риска, ведущий кпоявлению чувствительности к глюкозе и диабету II типа (Holland, Summers,2008). При ожирении большие количества триацилглицеридов (ТАГ)накапливаются в печени, часто в виде липидных везикул (lipid droplets).Накопление ТАГ в печени является лучшим индикатором/предвестникомдиабета II типа, чем вес тела или индекс массы тела. Печень играетцентральную роль в метаболизме и хранении жиров. В зависимости отгормонального статуса организма и типа питания гепатоциты окисляютжирные кислоты, поступающие из жировой ткани или других источниковлипопротеидов, и используют их для биосинтеза ТАГ и других липидов.Когда жиры поступают в организм в избытке, обогащенные ТАГ липидныевезикулы накапливаются в цитозоле, приводя к жировой дистрофии печени илипотоксичности.

Однако в этом случае накапливается еще и другой типлипидов ‒ церамиды, который вносит вклад в инсулино-устойчивость илипотоксичность из-за подавления фосфорилирования инсулин-рецепторногосубстратного белка IRS-1 в гепатоцитах и ингибирования активации Racбелка,переносаGlut-4-белка,мембранногопереносаглюкозыифосфорилирования протеинкиназы Akt-1 в миоцитах.

В биосинтезецерамидовучаствуютсериноваяпальмитоилтрансферазаикислаясфингомиелиназа (ASM), которая генерирует церамиды в результатегидролиза сфингомиелинов. ASM может играть важную роль в ожирении,поскольку она присутствует в больших количествах в адипозной ткани ивовлечена в патогенез атеросклероза, болезни, которая, как и диабет, связанас ожирением (Holland, Summers, 2008).Для исследования роли кислой сфингомиелиназы (ASM), важной длягомеостаза церамидов и связанной с резистентностью к инсулину, авторыработы (Deevska et al., 2009) создали делецию по гену asm у мышей,дефицитных по гену липопротеидов низкой плотности (ldlr).

Потомство34таких мышей помещалось на контрольную диету или модифицированнуюдиету на 10 недель. Модифицированная диета была обогащена насыщеннымижирами и холестерином. Авторы обнаружили, что модифицированная диетавызывала гиперхолестеринемию во всех генотипах (Deevska et al., 2009).Однако, в противоположность мышам asm//ldlr, молодой помет, имеющийдефицит сфингомиелиназы, не обнаруживает накопления триглицеридов впечени, хотя содержание сфингомиелина и других сфиголипидов былосущественно повышено, а печень была увеличена. Мыши asm//ldlr намодифицированной диете не накапливали жир, были защищены отиндуцированной диетой гипергликемии и были инсулин-резиситентны.Эксперименты с гепатоцитами показали, что кислая сфингомиелиназарегулирует деление главной жирной кислоты в модифицированной диете ‒пальмитиновой кислоты ‒ на два конкурентных и обратимых пула:триглицеридный и сфинголипидный, по-видимому, посредством модуляциисериновойпальмитоилтрансферазы,лимитирующейскоростьработыфермента, участвующего в синтезе (de novo) сфинголипидов.

В этомисследовании доказана важная роль кислой сфингомиелиназы в регуляциичувствительности к инсулину, в метаболизме глюкозы и в регуляциинакопления в печени пальмитатов триацилглицеридов и сфинголипидов прибогатой насыщенными жирами диете (Deevska et al., 2009).Известно, что у пациентов с болезнью Ниманна-Пика наблюдаетсядефицит ASM и недостаток веса (Holland, Summers, 2008). Для такихпациентов была исследована связь между богатой жирами диетой, уровнемцерамидов и устойчивостью к инсулину. Было доказано, что ASM играетважную роль в регуляции чувствительности к инсулину и глюкозе кровимодулированием участия пальмитиновой кислоты в сфинголипидном и TAГпулах в печени.

В другом исследовании было показано, что сфингомиелиназаограничивает латеральную диффузию белка CD4 и ингибирует слияниевируса иммунодефицита (Finnegan et al., 2007).35Липидомика ДНК-связанных липидов.Дизрегуляционная патология геномаКнастоящемувременинакопленодостаточноданныхдляобоснованного предположения, что нейтральные липиды и фосфолипидыпредставляют собой важные компоненты хроматина (Бойко др., 2008;Жданов, Кубатиев, 2003; Стручков, Стражевская, 1993; Шмырина, 2005; Albi,Magni, 2004; Murray, 1993; Struchkov et al., 2002а). Предполагается, чтолипиды в геномной ДНК представлены двумя фракциями: фракциейспирторастворимых, слабосвязанных с ДНК липидов (около 60% от общегоколичества липидов) и фракцией липидов, прочносвязанных с ДНК (около40%) (Стручков, Стражевская, 1993; 2000; Шмырина, 2005). Фосфолипидыхроматинаэукариотфосфатидилэтаноламинфосфатидилсерин(ФС,представлены(ФЭ,22%),10%),такимикомпонентами,фосфатидилхолинфосфатидилинозитол(ФХ,(ФИ,как14%),19%)исфингомиелин (СМ, 35%) (Шмырина, 2005; Albi et al., 1994).

Таким образом,ДНК-связанные липиды имеют специфический состав, отличающийся отлипидного состава ядерной мембраны и ядерного матрикса, где основныелипиды представлены холестерином, ФХ и СМ. Количественный составфракций ДНК-связанных липидов изменяется в зависимости от фазыклеточного цикла, метаболической активности клетки и при переходе ДНКиз суперспирализованной формы в релаксированную, а также под действиемионизирующей радиации и противоопухолевых препаратов in vivo (Стручков,Стражевская, 1993; Шмырина, 2005; Struchkov et al., 2002a,b,c; Zhdanov et al.,2001). Предполагается, что слабосвязанные липиды являются, скорее всего,компонентом липопротеинов и участвуют в регуляции транскрипции, апрочносвязанные ‒ в прикреплении петель ДНК к ядерному матриксу(Стручков, Стражевская, 1993).

Природные хроматин- и ДНК-связанныелипиды наряду с белками могут быть вовлечены в регуляцию экспрессиигенома. Показано, в частности, что жирные кислоты (Duplus et al., 2000;36Nakamura et al., 2004) и холестерин (Bene et al., 2001) участвуют в регуляцииэкспресии генов и могут регулировать и их транскрипцию (Jump, 2004), в тоже время являясь сигнальными молекулами (Cocco et al., 2001). К этимработам примыкают и данные по переносу функциональных генов спомощью катионных липидов (Богданенко, Ибрагимова, 2009; Жданов и др.,2009; Северин, Жданов, 1999; Шмырина, 2005; Duzgunes et al., 2003; Le Doux,2008a,b; Zhdanov et al., 2003), а также по модельным ДНК-мембраннымконтактам (Жданов и др., 2003а,б; 2005; Шмырина, 2005; Zhdanov, Kuvichkin,1993; Zhdanov et al., 2002b).

Таким образом, ДНК-связанные липиды важныдля структуры геномной ДНК и функционирования генома в целом (Farago,Groenbech-Jensen, 2007).Прочносвязанные липиды локализуются, очевидно, в двойной спиралиДНК, связываясь преимущественно с малой бороздкой. Такие липидыпредставляют большой интерес с точки зрения функциональной геномики ипатофизиологии, так как могут помочь выяснению деталей организациигеномной ДНК, регуляции экспрессии генов и патогенеза заболеваний(Шмырина, 2005; Zhdanov et al., 2003).В настоящее время хорошо известно, что хроматин и ДНК содержатнейтральныелипиды,свободныежирныекислотыифосфолипиды(Стручков, Стражевская, 1988; 1989; 2000; Шмырина, 2005; Alesenko,Chatterjee, 1995; Alesenko, Burlakova, 2002; Kolomiytseva et al., 2002;Struchkov et al., 2002a,b,с).На основании вышесказанного, заключаем, что липиды представляютсобой интегральную часть геномной ДНК человека и локализованы вдвойной спирали ДНК в виде специфической последовательности.

ЛипиднаяпоследовательностьгеномнойДНКможетбытьраскодирована,аструктурно-функциональная роль геномных липидов ‒ раскрыта. Научноерешение этих задач является предметом нового раздела геномики ‒липидомики ДНК и важно с точки зрения проблем современной патологии и37патофизиологии (Жданов, Ибрагимова, 2014г). Если удастся показать, что впатогенезе тех или иных заболеваний изменяется состав, а следовательно, ифункция ДНК-связанных липидов, то можно говорить о дизрегуляционнойпатологии генома (Жданов, Ибрагимова, 2014г; Свердлов, 2009).382.1.2. МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ПЕРЕКИСНОГООКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВПерекисноеокислениелипидовимеетважноезначениедляметаболизма органов и тканей (Maruyama et al., 2014).