Диссертация (1151325), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Правильно подобранные условияионизации и фрагментации совместно с внутренними стандартами позволяютбыстро и качественно определять клеточные липиды (Шмырина, 2005;Brugger et al., 1997; Byrdwell, 2001; Schlame et al., 1999). Последниеусовершенствованиявдаютпрямойвозможностьсфингомиелинавэлектроспрей-ионизационномэкстрактеидентификацииклеток.масс-спектрометреболееВычислительнаялипидомика интегрируется с другимичем400типов(компьютерная)высокими технологиями, чторасширяет наше понимание молекулярных основ клеточных процессов ипатогенеза заболеваний (Шмырина, 2005; Kagan et al., 2005; Koivusalo et al.,2001).
Последние разработки в электроспрей-ионизирующей МС (ESI-MS)делают возможным точное разделение и определение изменений в липидомеклетки в результате различных клеточных перестроек. Основную роль, помнению ряда авторов, в изучении липидома может играть ESI-MS, какнаиболее широко применяемый для изучения передачи сигнала и различногорода заболеваний (Жданов, Кубатиев, 2003; Шмырина, 2005; Brugger et al.,251997; Forrester et al., 2004; Han, Gross, 2005). ESI-MS не имеет себе равных почувствительности, специфичности иточности данных по изучениюлипидома.
Несомненно, что липидомика, вооруженная электроспрейионизационнойМС,«открываетдверь»дляисследованияпричинвозникновения заболеваний человека на новом уровне (Шмырина, 2005; Han,Gross, 2003; 2005).Возможность определения индивидуального состава жирных кислоттех или иных липидов является чрезвычайно мощным инструментом впознании структуры и функции биологических мембран, а также процессоввнутриклеточного метаболизма как в норме, так и при патологии (Жданов,Кубатиев, 2003; Шмырина, 2005).2.1.1.2.
Количественный анализ липидома с использованиемобщих экстрактов клеток и тканейВыделение липидов является одним из ключевых шагов в успешноманализе липидома клетки методами MALDI-TOF-MS, ESI-MS, а также спомощью газового хроматографа с масс-спектрометром (gas chromatographymass spectrometry GC-MS) (Валеева и др., 2008а; Шмырина, 2005; Christie,2003; Han, Gross, 2003; 2005; Lu, Harrington, 2010; Madonna et al., 2001;Mulyukin et al., 2005). Выделение липидов из биологических образцовобычноосуществляютэкстракциейорганическимирастворителями,триглицериды выделяют неполярными растворителями (четыреххлористымводородом, петролейным эфиром, хлороформом), для выделения общихлипидов широко используют смесь хлороформ : метанол, (это позволяетвыделить из объекта до 100 липидов) предложенную Фолчем, (Folch et al.,1957) или модифицированный метод Бли и Дайера (Bligh, Dyer, 1959).Липиды в тканях чаще всего встречаются в комплексе с белками иполисахаридами, где они взаимодействуют между собой с участиемгидрофобных взаимодействий, сил ван-дер-ваальса, а иногда и ионных сил.26При выделении липидов важно учитывать, что эндогенная вода в тканяхявляется неотъемлемым компонентом биологической системы.
Следуетотметить, что пропорции хлороформ : метанол : вода всегда должны бытьблизки к 8 : 4 : 3, в противном случае специфичность экстракции липидовможет ухудшиться (Шмырина, 2005; Christie, 2003). Для увеличения выходанеполярных липидов из образца по методике необходимо проводить реэкстракцию остатка ткани хлороформом и прибавлять этот экстракт кпредыдущему до упаривания растворителя. Смесь хлороформ : метанол,возможно, наилучшая для выделения липидов, но точно не избавляет образецот присутствия примесей. В работе А. Хара и Н. Радин предложена другаяэкстрагирующая липиды смесь – гексан : изопропанол с широким спектромдействия на разнообразные ткани (Шмырина, 2005; Hara, Radin, 1978).2.1.1.3. Международные центры и проекты по липидомикеПроекты по липидомике начинают получать значительную поддержкуот различных учреждений и фондов в США, например самая крупнаяпрограмма «Lipid Metabolites and Pathways Strategy (LIPID MAPS)».
Крометого, были созданы Центр по изучению проблем липидомики в патобиологии«COBRE in lipidomics and pathobiology» (США); Центр по липидомике«Kansas Lipidomics Research Center» при университете штата Канзас дляисследований механизмов проведения клеточных сигналов с участиемлипидных метаболитов в растениях (plant lipid signaling), а также Центр повычислительной липидомике «Computational Lipidomics» (УниверситетВандербильдта, США). В Европе самой крупной программой являетсяЕвропейская липидомная инициатива (European Lipidomics Initiative),объединившая 55 европейских лабораторий и групп, с координационнымцентром в Голландии, вышедшая на финансирование по Европейскойрамочной программе (15 мега Евро) в 2007 г. Таким образом, в настоящеевремя в области липидомики работает по крайней мере два крупных научных27консорциума: один в США и другой в Европе ‒ и три крупныхакадемических липидомных центра в США и Европе (European LipidomicsIntiative во Франции и в Институте цитологии и генетики Общества МаксаПланка, Дрезден, Германия).
Все усилия исследователей этих организацийнаправлены на решение вопросов, связанных с патогенезом и терапией такихсоциально важных заболеваний как, рак, сердечно-сосудистые заболевания,инсулин-независимый диабет, нейрологические заболевания, старение иожирение. В России к исследованиям в области липидомики можно отнеститрадиционные и современные направления в ряде ведущих лабораторийМосквы, Пущинского научного центра, Казани и др. по изучениюметаболизма арахидоновой кислоты и эйкозаноидов (Безуглов и др., 1996;Сергеева, Варфоломеева, 2006; Шмырина, 2005; Sergeeva et al., 2003),липидовтрансформированныхклеток(Дятловицкая,Кандыба,2006;Шмырина, 2005), липидов клеточного ядра (Безуглов, Коновалов, 2009;Стручков, Стражевская, 1993; 2000; Шмырина, 2005; Alеsenko, Сhatterjee,1995; Alesenko, Burlakova, 2002; Kolomiytseva et al., 2002), растительныхоксилипинов (Grechkin et al., 2000; 2005; 2008), ДНК-связанных липидов(Жданов, Кубатиев, 2003; Zhdanov et al., 2001; 2002a,b,c,d; 2003; 2005; 2006) и т.
д.По нашему мнению, в этих проектах внимание должно быть уделено иисследованию ДНК-связанных липидов (Жданов и др. 2014а; Московцев идр., 2012; Стручков, Стражевская, 1993; Шмырина, 2005; Struchkov et al.,2002 a,b) как структурных компонент хромосом и хроматина, которые,наряду с белками, могут быть вовлечены в процессы регуляции экспрессиигенов (Арчаков, Жданов, 2000; Шмырина, 2005; Duplus et al., 2000).282.1.1.4. Медицинские задачи, решаемые методами липидомикиЭйкозаноиды, наряду с другими липидными медиаторами, являютсяважнейшими регуляторами биологических процесов в организме, в частностивоспалительных процессов, дисрегуляция которых ведет к онкологическимзаболеваниям, атеросклерозу, артриту, гипералгезии (Алесенко, 1998;Безуглов, Коновалов, 2009; Новицкий и др., 2010; Lepore et al., 2014).Несмотря на их важность, до последнего времени не существовалоэкспериментального подхода для исчерпывающего количественного анализаметаболома эйкозаноидов, сравнимого по эффективности с ДНК ибелковыми микрочипами (Мутовин, 2010).
В рамках консорциума LIPIDMAPS несколько лабораторий под руководством E.A. Деннис (E.A. Dennis)разработалиэкспериментальные подходы,основанные на принципахлипидомики, для количественного анализа липидного метаболома (Blaho etal., 2009; Buczynski et al., 2009; Quehenberger et al., 2008). К настоящемувремени идентифицировано более ста различных эйкозаноидов, многие изкоторых обладают мощными сигнальными свойствами. Эти липидныеметаболиты синтезируются de novo с участием по крайней мере 50уникальных ферментов, многие из которых охарактеризованы и клонированы(Buczynski et al., 2009). Ввиду интенсивных работ, ведущихся похарактеризацииисследованийбиосинтетическихпредоставляетпутейуникальнуюэйкозаноидов,возможностьэтаобластьформированияинтегрированного подхода геномики-протеомики-липидомики для изученияпатогенеза различных болезней (Новицкий и др., 2010; Пальцев и др., 2009).Интенсивные геномные и липидомные исследования свидетельствуют о том,что проблемы сигнальных путей с участием эйкозаноидов могут бытьрешены лишь на основе анализа полного протеома эйкозаноидов (Buczynskiet al., 2009).В рамках проекта LIPID MAPS разработаны методы и способы анализалипидома в культивируемых линиях клеток и клетках первичной культуры.29Так, для анализа важных жирных кислот клеток линии RAW264.7 предложенметод, совмещающий газовую хроматографию и масс-спектрометрию(ГХ/МС), позволяющий идентифицировать и количественно проанализироватьболее 30 жирных кислот, присутствующих в клетках этой линии, за одинанализ (Quehenberger et al., 2008).
Свободные кислоты были избирательноэкстрагированы в присутствии дейтерированных стандартов, что позволяетпровести последующую оценку эффективности экстракции и точныйколичественныйанализ.Параметрымасс-спектрометрабылиоптимизированы для мониторинга одиночных ионов, что в конечном итогепозволило разработать очень чувствительную технологию для измеренияследовых количеств жирных кислот в биологических образцах. Такаятехнология была разработана с учетом ее применимости в проектах авторовпо анализу всех жирных кислот и их метаболитов в клетках при воспалении(Quehenberger et al., 2008).Технология, основанная на совместном применении жидкостнойхроматографии и тандемной масс-спектрометрии, была использована другойгруппой авторов под руководством E.A.
Деннис (E.A. Dennis) дляколичественного и качественного анализа эйкозаноидного метаболома приэкспериментальном артрите (болезнь Лайма) у мышей, инфицированныхбактерией Borrelia burgdorferi (Blaho et al., 2009). Эйкозаноиды былиэкстрагированы из хрящей инфицированных мышей, либо устойчивых, либочувствительных к артриту Лайма, и подвергнуты липидомному анализу.Авторы идентифицировали профили эйкозаноидов из хрящей этих линиймышей и проанализировали их временные и количественные различия (Blahoet al., 2009). Эти различия в синтезе эйкозаноидов коррелировали сразличиями в степени развития артрита. В регуляцию патогенеза артритаЛаймаоказалсявовлеченнымферментбиосинтезаэйкозаноидовциклооксигеназа (COX-2). Липидомно-метаболомный профиль хрящеймышей, инфицированных Borrelia burgdorferi, обнаружил не только30уменьшение продуктов COX-2 циклооксигеназного пути, но и значительноеснижение метаболитов 5-липооксигеназного пути (Blaho et al., 2009).
Этирезультаты, полученные авторами, демонстрируют перспективность иполезность исчерпывающего липидомного анализа для идентификацииприроды ключевого вклада в патогенез болезни и может способствоватьразработке других, более точных методов.Сфинголипидомика в биологии и медицине«Сфинголипидом» ‒ это часть липидома клетки, которая включаетсфинголипиды с различными сфингоидными остовами, которые могут бытьфосфорилированы, ацилированы, гликозилированы и модифицированы черезфосфодиэфирную связь или каким-либо другим способом (Mate et al., 2014;Zheng et al., 2006). Они обнаружены во всех эукариотах, в некоторыхпрокариотах и вирусах. Сфинголипидомика становится в настоящее времяважным средством понимания роли сфинголипидов, их метаболизма ифункции в системной биологии (Merrill et al., 2007), а также в патогенезеразличных заболеваний (Алесенко, 1998; Дятловицкая, Кандыба, 2006;Merrill et al., 2009; Zhang et al., 2014).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
