Диссертация (1151325), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Эта 12‒14 - знаковая система обеспечиваетединообразие написания и номенклатуры липидов, поскольку ранее одни и теже липиды могли быть названы и обозначены по-разному и представлены вразличных базах данных по-разному (Fahy et al., 2005; 2009).Таблица 1Основные категории липидов живой клетки согласно полнойклассификации LIPID MAPS (адаптировано из Fahy et al., 2009)Категория структуры липидаСокращенноеКоличествоназвание категории молекул липидовлипида в базеданной категорииданныхв базе данныхLIPID MAPS*Жирные кислотыЖК (FA)2678ГлицеролипидыГЛ (GL)3009ГлицерофосфолипидыГФ (GP)1970СфинголипидыCФ (SP)620Cтероидные липидыСТ (ST)1744Пренольные липидыПР (PR)610Cахаролипиды (гликолипиды)СЛ (SL)11ПоликетидыПК (PK)132* Структуры липидов LMSD получены из четырех источников: а) лабораторийконсорциума LIPID MAPS и их партнеров; б) липиды, идентифицированные вэкспериментах в рамках LIPID MAPS; в) структуры соответствующих классов липидов,генерированные с помощью компьютерных программ; г) липиды биологическогопоисхождения, взятые вручную из баз данных LIPID BANK, LIPIDAT и другихисточников (например, из научной литературы) (Sud et al., 2007).В жирных кислотах в классе эйкозаноидов появился подкласс пероксидов ‒hydroxy/hydroperoxyeicosapentaenoic acid ‒ и другие пероксиды, чтобы можнобыло учесть гидропероксиды.
Убраны названия подклассов, основанные на20источнике липидов, например фитостероиды и т. д., и введены подклассыстероидов, основанные на углеродном скелете ядра стероида: эргостерины(ergosterols), горгостероины (gorgosterols). Два новых класса липидоввключенывкатегориюглицеролипиды:glycosyldiradylglycerolsиglycosylmonoradylglycerols, чтобы учесть такие липиды растений, какsulfoquinovosyldiacylglycerols, обнаруженные в хлоропластах.
Позиционныестереоизомеры предусмотрены в LMSD и хранятся как одна структура суказанием количества изомеров в сокращении, которые могут быть, однако,получены по требованию. Например, 6 изомеров триглицерида с разнымиацильными остатками (radyl) при разных sn атомах глицеринового остоваприсутствуют в базе данных LMSD как LMGL03010043 c общим названиемTG(16:0/16:1(9Z)/18:1(9Z))[iso6] и систематическим названием 1-hexadecanoyl 2-(9Z-hexadecenoyl)-3-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycerol и обозначают липиднуюструктуру с 6 возможными позиционными изомерами (Sud et al., 2007).
Введя12- или 14-знаковый код липида в базу LMSD, можно получить информациюо его структурной формуле (а введя формулу, можно получить LM ID),принятом систематическом названии, категории, классе и подклассе липида,синонимах.Ниже перечислены существующие базы данных по липидам: LIPID BANK for Web (www.lipidbank.jp); LIPIDAT (www.lipidat.chemistry.ohio-state.edu); LIPID MAPS website (www.lipidmaps.org/data/standards/); LMSD (www.lipidmaps.org/data/structure/); LIPID MAPS Proteome Database (LMPD)(www.lipidmaps.org/data/proteome/index.cgi); Lipid Library (www.lipidlibrary.co.uk); Cyberlipids (www.cyberlipid.org); Glycosphingolipidome (www.sphingomap.org).21Во-вторых,сформулированыдваразличныхподходакинструментальному липидомному анализу клетки.1) Можно разработать протоколы экстракции, оптимизированные для каждойкатегории липидов и, в некоторых случаях, для классов липидов, а затемиспользовать жидкостную хроматографию для оптимального разделениясодержащихся липидных молекул.
Консорциум LIPID MAPS (Deems et al.,2007; Garrett et al., 2007ab; Ivanova et al., 2007; Krank et al., 2007; McDonaldet al., 2007; Sullards et al., 2007) предпочел именно этот подход.Хроматографические элюаты индивидуальных фракций впрыскиваютсязатем прямо в масс-спектрометр для дальнейшего (on-line) анализамолекулярной фрагментации (molecular fragmentation (MS/MS)), мониторингасложных реакций (multiple reaction monitoring (MRM)) и сканированиясложных ионов-предшественников (multiple precursor ion scanning (MPIS))(Dennis, 2009).2) Альтернативный подход, иногда именуемый «шот-ган» («shot-gun»)липидомики и используемый при липидомном исследовании дрожжей (Ejsinget al., 2009), состоит из двух этапов: тотальная экстракция липидов иисследование этих экстрактов с применением масс-спектрометрического(МС) анализа без разделения с помощью жидкостной хроматографии (ЖХ).Используются два типа протоколов экстракции: первый ‒ для выделенияболее гидрофобных и второй ‒ для выделения более полярных липидов.В некоторых экспериментах для оптимизации протокола используют либопредварительное ацетилирование, либо предварительное метиламинирование.Вэтихподходахприменяютиразныетипымасс-спектрометров:квадрупольный время-пролетный прибор с использованием мониторингамножественных реакций (multiple reaction monitoring, MRM), MPIS и linearion trap ‒ orbitrap, прибор, позволяющий определять массу с очень высокойточностью.
Кроме того, различными приборами анализируют образцы врежимах отрицательной и положительной ионизации.22В-третьих, проанализирован первый липидом (Carvalho et al., 2012).В 2009 году опубликован первый результат липидомного анализаэукариотической клетки ‒ дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Ejsing et al.,2009), полученный методами масс-спектрометрии (МС, MS) в сочетании скомпьютерными программами количественного анализа данных. Выбравэтот организм, авторы серьезно упростили задачу по сравнению с клеткамимлекопитающих, где число липидных молекул могло бы измерятьсядесятками тысяч: этот штамм может расти на среде, лишенной липидов, испособен синтезировать лишь ограниченное число жирных кислот и ихненасыщенных производных (16:0/16:1 cis-9 и 18:0/18:1 cis-9) (Ejsing et al.,2009).
Авторы идентифицировали 342 липида, из которых состоит мембранаSaccharomyces cerevisiae, что составляет 95% липидных молекул этогоштамма и представляет шесть из восьми категорий липидов (табл. 1). Авторыданной работы использовали второй подход к липидомному анализудрожжевой клетки. Этот крайне сложный пул данных, полученный сиспользованием двух типов экстракции в двух разных режимах на двухразных типах приборов, был проанализирован с помощью специальноразработанныхкомпьютерныхпрограмм.Такойподход«shot-gun»липидомики позволил авторам идентифицировать 21 различный типлипидов, которые состояли из 342 индивидуальных липидных молекул. Вработе был использован набор стандартных образцов липидных молекулAvanti Polar Lipids, который был авторами критически проанализирован(Moore et al., 2007); причем ими был создан и использован ряд собственныхстандартов фитосфинголипидов.
Некоторые данные по липидому дрожжейбыли получены традиционными исследованиями ферментов метаболизмалипидов, секвенированием генов и генетическими манипуляциями, знаниегенов и транскриптов не всегда может предсказать уровни активных белков иферментов. Знание уровней конкретных липидных метаболитов болеепредсказательнодляанализаметаболизма.Указаннаяработадает23количественную информацию об уровнях липидных метаболитов и ихизменений при делециях определенных генов, что увеличивает нашепонимание метаболизма (Dennis, 2009; Ejsing et al., 2009).В-четвертых,полученыданные,проясняющиепатогенезрядазаболеваний (см.
§ 2.1.1.4).2.1.1.1. Инструментальные методы липидомики:тандемная масс-спектрометрия (ТМС), время-пролетная лазернаядесорбция и ионизация с помощью матрикса (MALDI-TOF),электроспрей-ионизация‒масс-спектрометрия (ESI-MS), жидкостнаяхроматография‒масс-спектрометрия (LC-MS/MS)Анализлипидовифосфолипидовобычноосновываетсянахроматографических методах, таких как тонкослойная хроматография иливысокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) (Шмырина, 2005;Schiller et al., 2004).
Хромато-масс-спектрометрия ‒ новый этап развитияжидкостной хроматографии (ЖХ) (Зеленин, 1996; Шмырина, 2005; Evershed,1992). Масс-спектрометр обладает способностью не только зарегистрироватьпоявление в нем разделяемого компонента, но и установить его структуру(Шмырина, 2005; Murphy, 1993; 2009). Широкое применение хромато-массспектрометров вызвало необходимость создания библиотек ‒ баз данныхмасс-спектров всевозможных соединений (обычно 10-50 тысяч), которыекоммерчески доступны. Мягкие ионизационные методы ‒ электроспрейионизация (ESI) и матрикс-совмещенная лазерная десорбция и ионизация(MALDI-TOF) ‒ появились в конце 80-х годов XX века и усовершенствовалимасс-спектрометрию (Шмырина, 2005; Camargo et al., 2014; Schiller et al.,2004). Оба метода, ESI и MALDI-TOF, дают возможность анализабиомолекул с большим молекулярным весом без существенного разрушения,и поэтому с большой вероятностью можно определять молекулярный ион.Среди мягких ионизирующих методов анализа полярных биомолекул ESI-MS24и MALDI-TOF являются наиболее перспективными для биологической массспектрометрии, поскольку эти методики применимы для растворов, нетребуютпроцедурыупаривания,характеризуютсявысокойчувствительностью, умеренной экспериментальной сложностью и хорошейвоспроизводимостью данных (Шмырина, 2005; Brugger et al., 1997; Forresteret al., 2004).Нано-электроспрей‒масс-спектрометрияпозволяетпроводитьколичественный и качественный анализ смеси мембранных липидов насубпикомольном уровне.
Эта методика избирательна в детекции отдельныхклассов фосфолипидов из общего экстракта клеточных липидов. С помощьюэтогометодаможноидентифицировать:фосфатидилхолин(ФХ),сфингомиелин (СМ), фосфатидилинозит (ФИ), фосфатидилэтаноламин (ФЭ),фосфатидилсерин (ФС), фосфатидилглицерин (ФГ), фосфатидные кислоты(ФК) и их плазмалогенные аналоги.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
