Автореферат (Эффекты гиперэкспрессии гена белка предшественника амилоида в нервных клетках дрозофилы и поиск антиамилоидогенных соединений)

На правах рукописиРОДИН Дмитрий ИгоревичЭффекты гиперэкспрессии гена белка предшественника амилоидав нервных клетках дрозофилы и поиск антиамилоидогенных соединений03.02.07 – генетикаАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата биологических наукСанкт-Петербург20142Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении«Петербургскийинститутядернойфизикиим. Б. П. Константинова»Национального исследовательского центра «Курчатовский институт», г. ГатчинаНаучный руководитель:доктор биологических наукСаранцева Светлана Владимировна,заместительдиректора,заведующаялабораторией экспериментальной и прикладнойгенетики ФГБУ «ПИЯФ» НИЦ «Курчатовскийинститут», г.

Гатчина.Официальные оппоненты:доктор медицинских наукЧухловин Алексей Борисович,профессор кафедры клинической лабораторнойдиагностики ГБОУ ВПО «Первый СанктПетербургский государственный медицинскийуниверситетим.акад.И. П. Павлова»Минздрава РФ, г. Санкт-Петербург,кандидат биологических наукНикитина Екатерина Александровна,старший научный сотрудник, заместительзаведующеголабораториейнейрогенетикиИнститута физиологии им. И. П. Павлова РАН,г. Санкт-Петербург.Ведущее учреждение:Федеральноегосударственноебюджетноеучреждение науки Институт молекулярнойгенетики Российской академии наук.Защита состоится «___» __________ 2015 г.

в _____ часов на заседаниидиссертационного совета Д 212.232.12 на базе Санкт-Петербургскогогосударственного университета по адресу: 199034, г. Санкт-Петербург,Университетская наб., д. 7/9, Санкт-Петербургский государственный университет,биологический факультет, кафедра генетики и биотехнологии, аудитория 1.С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. М.

Горького СанктПетербургского государственного университета.Автореферат разослан «___» ___________ 2014 г.Ученый секретарьдиссертационного совета Д 212.232.12доктор биологических наукЛ. А. Мамон3ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность проблемы. Белок-предшественник амилоида (APP) –крупный трансмембранный белок, в большом количестве обнаруживаемый всинапсах нейронов. Белок принимает участие в развитии различных заболеваний,среди которых можно выделить синдром Дауна, амилоидную ангиопатию иболезнь Альцгеймера. На сегодняшний день функции АРР неясны.

Однако былопоказано, что он участвует в разнообразных процессах, включающих клеточнуюадгезию, клеточную сигнализацию, формирование структуры и функциинейронов [Breen et al., 1991; Neve et al., 2007; Stante et al., 2009].Основным механизмом протеолиза APP является его расщепление тремяпротеазами, получившими название α-, β- и γ-секретазы. Процессинг APPосуществляется по так называемому амилоидогенному (при участии β- и γсекретазы) и неамилоидогенному пути (при участии α- и γ-секретазы). Основнымотличием является то, что в случае амилоидогенного пути происходитобразование небольшого по размерам амилоид-бета-пептида (Аβ). В свою очередьнарушение метаболизма Аβ приводит к его агрегированию и образованию такназываемых сенильных бляшек – одного из главных маркеров широкораспространенного старческого нейродегенеративного заболевания – болезниАльцгеймера (БА).БА – одна из значимых медицинских проблем современного мира,характеризующаяся тяжелой и разнообразной симптоматикой, включающейамнезию, зрительно-пространственные и временные нарушения, алексию,аграфию.

Дальнейшее прогрессирование заболевания ведет к общемуфизическому истощению и в конечном итоге к летальному исходу. В аутоптатемозга пациентов обычно обнаруживаются классические маркеры БА – деградациятканей мозга и наличие нейрофибриллярных клубков, основным компонентомкоторых является гиперфософрилированный белок тау, и амилоидных бляшек,состоящих в основном из агрегированного Аβ.На сегодняшний день не существует эффективного способа лечения БА.

Загоды исследований заболевания было протестировано и отвергнуто множествопрепаратов. В большей степени это связано с отсутствием глубинного пониманиямеханизмов, ведущих к развитию патологии. Тем не менее, с каждым годом числотестируемых препаратов растет. Наиболее перспективными являются соединения,обладающие антиамилоидогенной активностью, т. е. способные восстанавливатьгомеостаз Аβ.Согласно гипотезе амилоидного каскада токсичные растворимые формы Аβзапускают каскад патологических процессов, приводящих в итоге к дисфункциинейронов, нарушению синаптической передачи и когнитивным изменениям.Несмотря на наличие множества данных, бесспорно подтверждающихправомерность амилоидной гипотезы, более пристальное изучение вопросапоследних лет показало, что не только вызываемый Аβ каскад патологическихизменений, но и ряд других не связанных или опосредованно связанных с Аβпараллельных процессов может вести к манифестации клиническойсимптоматики заболевания.

Среди этих процессов можно выделитьпатологические изменения цитоскелета нейрона, нарушение антиоксидантной4системы, нарушение апоптоза, изменение клеточного метаболизма и др. [Brion,1998; Peers et al., 2007; Kumar-Singh, 2008; Kroner, 2009; Su et al., 2008, BermejoPareja et al., 2010].Кроме того, не до конца ясна функция полноразмерного белка APP и другихего фрагментов в развитии нейродегенерации. Долгое время APP рассматривалсяисключительно как источник Аβ. В то же время ряд исследований показывает, чтонарушение нормальной функции APP может также приводить к развитиюразнообразных патологий нервной системы [Rovelet-Lecrux et al., 2005].Определение роли APP в развитии патологических процессов, наблюдаемых приБА, – ключевой момент для понимания базисных молекулярных механизмов,ведущих к развитию заболевания, что крайне важно для разработки эффективныхметодов лечения.Цель и задачи исследования.

Основная цель диссертационной работы –исследовать эффекты гиперэкспрессии гена АРР в нервной системе Drosophilamelanogaster и охарактеризовать, как содержание трансгенных особей Drosophilaна среде с дрожжами Saccharomyces cerevisiae, мутантными по гену ADE2и продуцирующими красный пигмент, влияет на нейродегенерацию иамилоидогенез. В работе поставлены следующие задачи:1. ПроанализироватьморфологическиедефектыразвитияособейDr. melanogaster с гиперэкспрессией в нервных клетках гена АРР, АРР с мутациейSwedish, а также с образованием Аβ42.2. Используя трансгенные линии Dr.

melanogaster, изучить влияниеэкспрессии АРР, АРР с мутацией Swedish, последовательностей, кодирующихукороченные формы APP, а также образования Аβ42 на транскрипционнуюактивность генов пресинаптических белков.3. Определить влияние содержания особей Drosophila c экспрессиейпоследовательности, кодирующей пептид Аβ42, на среде с дрожжамиSac. cerevisiae, продуцирующими красный пигмент, на уровень растворимого иагрегированного Аβ42 в мозге мух.4.

Исследовать влияние содержания трансгенных Dr. melanogaster на среде сдрожжамиSac. cerevisiae,продуцирующимикрасныйпигмент,напродолжительность жизни и поведение мух.Научная новизна. В работе продемонстрировано влияние гиперэкспрессиигена APP на развитие Dr. melanogaster. Показано, что нарушение экспрессии APPможет независимо от Аβ приводить к морфологическим аномалиям развития мух.Кроме того, оценено влияние как APP и его форм, так и Аβ 42 натранскрипционные изменения генов пресинаптических белков синаптотагмина инейронального синаптобревина в мозге Dr. melanogaster. Впервые in vivoпродемонстрировано позитивное влияние потребления дрожжей-продуцентовкрасного пигмента на содержание растворимой и нерастворимой фракции Аβ 42, атакже на когнитивные функции Drosophila с экспрессией последовательности,кодирующей пептид Аβ42.Теоретическоеипрактическоезначениеработы.Изучение5патогенетических основ развития БА – критически необходимое условие длясоздания полноценной многофакторной теории возникновения заболевания.Исследование роли основных участников патогенеза БА и анализ первичныхтранскрипционных и эпигенетических изменений важны не только с научнойточки зрения, но и имеют значительный практический смысл, так как пониманиемеханизмов, вызывающих начальные нейродегенеративные изменения –ключевое условие как для разработки новых методов диагностирования, так и дляпоиска новых эффективных терапевтических препаратов для лечения БА.Основные положения, выносимые на защиту:• Нарушение нормальных функций белка APP ведет к активации иммунногоответа и соответствующей воспалительной реакции, вызывая тем самымпатоморфологические дефекты развития и функционирования организмов.• Нарушение метаболизма APP независимо от Аβ42 влияет на синаптическуюплотность в мозге за счет негативной регуляции экспрессии геновсинаптических белков.

Определенный вклад в регуляцию транскрипциивносят эпигенетические факторы.• Содержание трансгенных линий дрозофилы на среде с мутантнымидрожжами Sac. cerevisiae, производящими красный пигмент, позитивно влияетна когнитивные функции и существенно снижает уровень Аβ42 в мозге.Апробация работы. Результаты, предложенные к защите, былипредставлены на следующих отечественных и международных конференциях:V Международной научной конференции для студентов и аспирантов «Молодежьи прогресс биологии» (Львов, 2009); VII Международной научной конференциидля студентов и аспирантов «Молодежь и прогресс биологии» (Львов, 2011);Европейской конференции по генетике человека (Готенбург, 2010);IX Курчатовской молодежной научной школе (Москва, 2011); Всероссийскойконференции с международным участием «Эмбриональное развитие, морфогенези эволюция» (Санкт-Петербург, 2013).Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, втом числе 4 статьи опубликованы в журналах, включенных в список ВАК,1 статья – в научном сборнике и 4 статьи – в материалах российских имеждународных конференций.Объем и структура диссертации. Диссертационная работа включаетвведение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования,результаты и обсуждение, 25 рисунков, 5 таблиц, заключение, выводы и списоклитературы, содержащий 161 источник. Работа изложена на 104 страницах.СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ1. Материалы и методы исследованияБыли использованы следующие линии Dr. melanogaster: UAS-APP(содержит ген АРР человека); UAS-АРР-Swedish (содержит ген APP с мутациейSwedish); UAS-APPNT (содержит укороченную форму гена APP695, в которой6последовательностьсигнальногопептидасоединенанапрямуюспоследовательностью, кодирующей Aβ, трансмембранным доменом ицитоплазматическом хвостом); UAS-APPСT (содержит укороченную форму генаAPP695, в которой удалена большая часть цитоплазматического конца, заисключением короткого мембранного якоря); UAS-APP.Abeta42 (содержитпоследовательность, кодирующую Aβ42); UAS-BACE (содержит ген бетасекретазы человека); UAS-PSEN1 (содержит ген пресенилина 1 человека); UASPSEN1.M146V (содержит ген пресенилина 1 человека с мутацией, приводящей кодноаминокислотному замещению M146V); UAS-PSEN1.P267S (содержит генпресенилина 1 человека с мутацией, приводящей к одноаминокислотномузамещению P267S); UAS-GFP (содержит последовательность, кодирующую белокGFP).Экспрессия данных генов была проведена в системе GAL4-UAS при помощиактиватора транскрипции elav-Gal4, запускающего транскрипцию в нервныхклетках.Линии получены из коллекции Drosophila Bloomington Stock Center.