Диссертация (Эффекты и механизмы ишемического прекондиционирования и посткондиционирования головного мозга), страница 6

et al., 1999). Наличие быстрого защитногоответа или развитие ранней ишемической толерантности было обнаружено и вдругих экспериментальных исследованиях с применением фокальной (ШмонинА.А. с соавт., 2011) и глобальной (Pérez-Pinzón M.A. et al., 1997) ишемииголовного мозга у крыс.Таким образом, выделяют две фазы ишемической толерантности мозга вответнапредварительныесублетальныестимулы:ранняяипоздняятолерантность, механизмы которых существенно различаются. Большинствоиндукторов, в том числе ишемия и гипоксия, индуцируют оба типа ишемическойтолерантности (Kitagawa K. et al., 1990; Gidday J.M., 2006; Obrenovitch T.P., 2008;Rybnikova E., Samoilov M., 2015). При ранней толерантности протективный ответвозникает через несколько минут после воздействия сублетального стимула идлится до нескольких часов, после чего быстро исчезает.

Для реализацииотсроченной толерантности необходимо как минимум 24 часа с моментананесения сублетального стимула, причем нейропротективный эффект позднейтолерантности длится от нескольких дней до нескольких недель. Общепринятосчитать, что ранняя толерантность или ранняя фаза ПреК обусловленаизменениями внутриклеточного метаболизма, возникающими в результатепосттрансляционноймодификациирегуляторныхбелков.Инапротив,отсроченная толерантность для своей реализации требует синтеза белков de novo.27Было установлено, что ишемическое прекондиционирование приводит кизменению уровня экспрессии многих генов, которое в свою очередь приводит кнейропротективному фенотипу (Obrenovitch T.P., 2008).

В данной главепреимущественнорассматриваютсямеханизмыпозднейишемическойтолерантности, имеющей более важное практическое значение.1.1.1 Сигнальные пути ишемического прекондиционирования головного мозгаСпособность того или иного индуктора ишемической толерантностивызывать повышение устойчивости головного мозга к последующей длительнойишемии определяется такими факторами, как продолжительность, интенсивностьикратностьвоздействия.Внекоторыхслучаяхсуммарная«доза»прекондиционирующего стимула слишком мала для того, чтобы вызватьдостаточную активацию адаптивных механизмов, тогда как в других случаях,напротив, интенсивность ПреК чрезмерно велика, что приводит к повреждению.ПреК головного мозга с помощью коротких эпизодов ишемии-реперфузии илигипоксии-реоксигенации изучено лучше всего.В процессе повышения устойчивости ткани головного мозга к ишемииможно выделить несколько последовательных этапов, в реализации которыхзадействованыразличныемолекулярныемишени,аименно:сенсорыпрекондиционирущего стимула, трансдукторы сигнала и конечные эффекторы(рис.

1.3). В роли сенсоров прекондиционирующего стимула, как правило,выступают мембранные рецепторы, активирующиеся либо под воздействиембиологически активных соединений, выделяющихся из клеток после ихстимуляциииндуктором,либонепосредственноиндуктораишемическойтолерантности в том случае, если он имеет химическую природу. В частности, вкачестве сенсоров могут выступать А1 аденозиновые рецепторы (Heurteaux C.

etal., 1995), поскольку защитный эффект ПреК устранялся введением антагонистовданного подтипа аденозиновых рецепторов в экспериментах на монгольскихпесчанках (Kawahara N. et al., 1998; Hiraide T. et al., 2001). Некоторые28молекулярные мишени могут одновременно выступать и как сенсоры, и какиндукторы развития ишемической толерантности головного мозга.К трансдукторам сигнала относятся вторичные мессенджеры, киназныекаскады и транскрипционные факторы (Gidday J.M., 2006). К трансдукторамсигналаотносятмитоген–активируемыепротеинкиназы(MAPK)иихфосфорилированные подсемейства (Ras, Raf, MEK, ERK) (Gonzalez-Zulueta M. etal., 2000; Jones N.M., Bergeron M., 2004), Akt (протеинкиназа В) (Wick A.

et al.,2002; Hashiguchi A. et al., 2004) и изоформу ε протеинкиназы C (Raval A.P. et al.,2003). В ряде исследований в процессах трансдукции прекондиционирующегоРис. 1.3. Сигнальные пути ишемической толерантности головного мозга.стимула доказана роль эндотелиальной, нейрональной и индуцибельной изоформсинтазы оксида азота (Atochin D.N. et al., 2003; Kapinya K.J., 2005; Kawahara K.

etal., 2004). Учитывая тот факт, что многие киназы и транскрипционные факторыявляются редокс-чувствительными, активные формы кислорода (АФК) такжеможно считать трансдукторами или преобразователями протективного сигнала(Puisieux F. et al., 2004; Zhang X. et al., 2004).К трансдукторам сигнала при формировании ишемической толерантностиотносят целый ряд транскрипционных факторов, в частности, белок-активатор 1(AP1),цАМФ–зависимыйсвязывающийбелок(CREB),ядерный29транскрипционный фактор-κB (NF-κB) и др.

Одним из наиболее хорошоизученных ключевых транскрипционных факторов, вовлеченных в формированиеишемической толерантности головного мозга, является индуцируемый гипоксиейфактор 1 (HIF-1). HIF-1 – это транскрипционный фактор, регулирующийэкспрессию более чем 200 генов, играющих важную роль в формированииустойчивости к ишемии и гипоксии (Loor G., Schumacker P.T., 2008). HIF-1представляет собой гетеродимер, состоящий из двух субъединиц – α и β. Принормоксии (рO2~100 мм рт. ст.) α-субъединица HIF-1 подвергается деградации впротеасомах, что делает активацию HIF-1-зависимых генов невозможной.

ОднакоприпонижениинапряжениякислородавтканяхHIF-1приобретаетфункциональную активность, в результате чего активируется экспрессия целогоряда генов. В частности, происходит повышение синтеза таких гликолитическихферментов, как фосфофруктокиназа, пируваткиназа, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, фосфоглицераткиназа и др.

(Semenza G.L. et al., 1996; Iyer N.V. etal., 1998). Это обеспечивает усиление образования АТФ в результате анаэробногометаболизма глюкозы. С другой стороны, HIF-1 усиливает экспрессиюмембранных транспортеров глюкозы (GLUT1 и GLUT3), что дополнительноспособствует включению глюкозы в гликолитический путь. К HIF-1-зависимымгенам относятся также гены индуцибельной NO-синтазы и циклооксигеназы-2.Оба фермента обладают нейропротективными эффектами, в основном за счетвазодилатации и улучшения коронарного кровотока. Еще одна группа генов,транскрипция которых усиливается под действием HIF-1, это гены факторовроста, в частности, сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) (ЦыганН.В.

с соавт., 2015). Установлено, что HIF-1 участвует в реализациинейропротективного эффекта ПреК при ишемическом инсульте, а также принекоторых нейродегенеративных заболеваниях (Hollmann M. et al., 1991). ПреКстимулирует образование в митохондриях небольших количеств АФК, которыеингибируют активность пролил-гидроксилазы (PHD), тем самым защищая HIF-1субъединицы от деградации в протеасомах (Tanaka H.

et al., 2000; Correia S.C. etal., 2010). Активный димер HIF-1 транслоцируется в ядро, где активирует30экспрессию вышеуказанных цитопротективных белков (Hollmann M. et al., 1991;Correia S.C. et al., 2010).Наконец,устойчивостиэффекторытканинепосредственноголовногомозгакотвечаютишемии.заДолгоеповышениевремясредиисследователей ишемической толерантности мозга доминировал взгляд о том, чторазнообразные трансдукторы сигнала активируют единственный конечныйэффектор.

В качестве конечного эффектора рассматривались мембранные имитохондриальные АТФ-чувствительные калиевые каналы (Heurteaux C. et al.,1995; Yoshida M. et al., 2004). По мнению ряда авторов, активациямитохондриальных АТФ-чувствительных калиевых каналов, возникающая в ходеИПреК, непосредственно ведет к росту устойчивости нейронов к ишемии за счетумеренного отека матрикса митохондрий, оптимизирующего процесс продукцииАТФ, ослабления поступления Са2+ в митохондрии и уменьшения образованияповреждающих концентраций АФК в ходе реперфузии (Дерягин О.Г. с соавт.,2012). Однако в обзорах по механизмам ишемической толерантности этот взглядподвергнут серьезной критике и даже ставится под сомнение само существованиемитохондриальных АТФ-чувствительных калиевых каналов, поскольку генысубъединиц данных каналов никогда не были с точностью идентифицированы иклонированы.

В настоящее время предлагается рассматривать не единыйконечный эффектор ИПреК головного мозга, а комплексный геномный ответ,приводящий к изменению уровня экспрессии многих белков-эффекторов,ответственных за выживание нейронов в ходе ишемии и последующейреперфузии (Stenzel-Poore M.P. et al., 2003; Stenzel-Poore M.P. et al., 2004). Ктакого рода механизмам относят ослабление эксайтотоксичности, активациюэндогенныхантиоксидантныхсистем,противовоспалительныеэффекты,модуляцию функции глиальных клеток, изменения регионарного кровотока,сосудистой реактивности и др. (Kapinya K.J., 2005; Gidday J.M., 2006; Dirnagl U. etal., 2009).Гены, активированные ИПреК, существенно отличаются от генов,активация которых происходит при ишемии без ИПреК.

Закономерности31генетических изменений, индуцированных 15-минутным ИПреК перед 60минутной фокальной ишемией головного мозга, были изучены у мышей. Припомощи микрочипового анализа сравнивали количество экспрессирующихсягенов при ишемии без ИПреК и с ИПреК. Было установлено, что через три часапосле ишемии экспрессия генов совпадала в двух группах на 37%, а через 24 часапосле ишемии только на 17%. Более того, был сделан вывод, что гены,экспрессирующиеся после применения ИПреК, не совпадают с генами,экспрессирующимися при повреждающей ишемии в отсутствии ИПреК. Присравнении количества экспрессированных генов при ишемии с ИПреК и без негобыло установлено, что при ишемии количество экспрессирующихся геновзначительно возрастает, в то время как при ишемии с ИПреК оно уменьшается до77%.

Было выдвинуто предположение, что ИПреК приводит к изменению вколичестве транскрибируемых генов, т.е. супрессирует часть генов, проявляя,таким образом, протективный эффект (Stenzel-Poore M.P. et al., 2003; StenzelPoore M.P. et al., 2004).Изменения экспрессии генов в головном мозга после ИПреК имеютразличныевременныепрофили.Так,послеИПреКнекоторыегеныэкспрессируются или репрессируются в течение нескольких минут или часов, адля изменения уровня экспрессии других генов требуется несколько дней.