Диссертация (Функциональная гетерогенность Na,K-АТФазы в скелетной мышце), страница 12

Каждое значение получено при измерении МПП в 154 – 184волокнах. ** p < 0.01 – различие между указанными районами мембраныТаким образом, особенностью распределения 2-изоформы Na,K-АТФазы всарколемме является локализация одного из её пулов в области концевойпластинки,гдеэтаизоформаучаствуетвфизиологическоммеханизмеподдержания мышечного электрогенеза.3.2.2. Функциональная связь никотиновых холинорецепторов и 2изоформы Na,K-АТФазыI. Проверка ионного механизма модуляции Na,K-АТФазы.Наиболеевероятнойпричинойлокальнойгиперполяризациипостсинаптического района мембраны является функциональное взаимодействиемежду нХР и 2-изоформой Na,K-АТФазы, что базируется на данных о прямоммолекулярном взаимодействии этих белков (Krivoi et al., 2006; Heiny et al., 2010;Matchkov, Krivoi, 2016). Как отмечалось выше, следовая гиперполяризациямембраны ганглионарных нейронов крысы после спайковой активности или после65действия микромолярных концентраций АХ в основном осуществляется за счётвходящих через каналы нХР ионов натрия, активирующих Na,K-АТФазу (Park etal., 2010).

Насколько значим вход ионов натрия через каналы нХР при действиинаномолярных концентраций АХ в синаптической щели, если константыактивации нХР составляют десятки мкМ (Peper et al., 1982; Garland et al., 1998)?Для ответа на этот вопрос мы использовали никотин, негидролизуемыйаналог АХ. В течение 15 - 45 мин m. soleus крысы инкубировали в нормальномфизрастворе и в растворе с добавлением 100 нМ никотина. Внутриклеточнуюконцентрацию ионов натрия и калия измеряли методом пламенной фотометрии(см.Методику).Послепреинкубациисникотиномбылообнаруженостатистически значимое (p < 0.01) увеличение внутриклеточной концентрацииионов натрия на 22 %.

Концентрация ионов калия не изменялась (рис. 3.6). Тоесть возможность накопления натрия внутри клетки при действии даженаномолярных концентраций агонистов нХР существует, но может ли это бытьмеханизмом функционального взаимодействия между нХР и 2-изоформой Na,KАТФазы и причиной локальной гиперполяризации мембраны?K90+Концентрация(мкМ/г сухого веса)807060504030+Na20*100Рис. 3.6. Измерение внутриклеточной концентрации ионов натрия и калияметодом пламенной фотометрии в m. soleus крысы. Светлые столбцы – контроль;темные столбцы – преинкубация в растворе, содержащем 100 нМ никотина.Количество мышц – 12.

* p < 0.05.66Для проверки такой возможности в другой серии экспериментов мызаменяли NaCl в омывающем растворе на N-methyl-d-glucamine chloride (NMGCl). NMG+ является непроникающим катионом и такой подход используется дляпредотвращения входа ионов натрия в клетку (Henning et al., 1994). Замена NaCl врастворе на NMG-Cl никак не сказывалась на величине МПП в обоих районахсарколеммы,локальнаягиперполяризацияпостсинаптическоймембранысохранялась (рис. 3.7).МПП, мВКонтрольNMG-Cl120 минNMG-Cl 120 мин+ никотин 100 нМ60 мин-77-78-79-80-81-82-83****Рис. 3.7. Влияние замены наружного натрия на NMG-Cl и добавленияникотина (100 нМ) на МПП мышечных волокон диафрагмы крысы вовнесинаптическом (светлые столбцы) и в постсинаптическом (темные столбцы)районах мембраны.

Каждое значение МПП представляет собой среднее значениеизмерений в более чем 150 мышечных волокнах. ** p < 0.01 – различие междууказанными районами мембраны.Важно отметить, что добавление 100 нМ никотина в присутствии NMG-Clвызывало гиперполяризацию внесинаптической мембраны величиной около 4 мВ(p < 0.01) (рис. 3.7). Такое гиперполяризующее действие наномолярных67концентрацийагонистов хХРбылопродемонстрированоранееибылоустановлено, что эффект реализуется через функциональное взаимодействиемежду внесинаптическими нХР и 2-изоформой Na,K-АТФазы (Кривой и др.,2004; Krivoi et al., 2006; Heiny et al., 2010). Однако никотин в наших опытах никакне влиял на величину МПП в постсинаптическом районе мембраны (рис.

3.7).Показано, что АХ вызывает гиперполяризацию внесинаптической мембраны сполумаксимальной эффективной концентрацией (ЕС50) около 30 нМ (Кривой идр., 2004; Krivoi et al., 2006). Поэтому можно предположить, что концентрациянеквантового АХ в синаптической щели, достигающая 50 нМ (Vyskocil et al.,1983), является насыщающей, то есть создает максимальное увеличениеэлектрогенной активности Na,K-АТФазы. В результате добавление 100 нМникотина или АХ к уже имеющемуся неквантовому АХ в синаптической щелиоказывается неэффективным.Поэтому дальнейший анализ функционального взаимодействия междунХР/2-изоформа Na,K-АТФазы нам было удобнее проводить на «модели»внесинаптической мембраны.Вначале мы исследовали динамику развития гиперполяризующего эффекта100 нМ АХ в мышечных волокнах диафрагмы крысы.

В контрольных опытахдобавление АХ в течение первых 2 – 4 мин вызывало статистически значимуюдеполяризацию мембраны величиной около 3 – 4 мВ (р < 0.01). К 5 – 6 миндействия АХ величина МПП возвращалась к исходному значению. Далеенаблюдалась постепенно развивающаяся гиперполяризация, достигающая ~4 мВ(р < 0.01) к 15 мин действия АХ. В течение 5 мин после удаления АХ величинаМПП возвращалась к исходному значению (рис. 3.8). Наличие начальной фазыдеполяризации может свидетельствовать об открывании части нХР при действии100 нМ АХ. Поскольку константы активации нХРсоставляют десятки мкМ(Peper et al., 1982; Garland et al., 1998), наблюдаемая деполяризация, по-видимому,объясняется открыванием ионных каналов лишь очень незначительной фракциинХР.68АХ-74МПП, мВ-76-78-80-82-84-10-505101520253035Время, минРис.

3.8. Динамика МПП мышечных волокон диафрагмы крысы придействии и отмывании АХ в концентрации 100 нМ. Темные кружки – внормальном физиологическом растворе; светлые кружки – в присутствии 5 мкМпроадифена (30 мин преинкубации перед добавлением АХ). Горизонтальнойлинией отмечено время присутствия АХ в растворе. Каждая точка представляетсобой среднее 30 – 50 измерений МПП в 8 мышцах в контроле и в 6 мышцах вприсутствии проадифена.Для проверки этого предположения в последующих опытах применялилокальный анестетик проадифен, являющийся также известным блокаторомионного канала нХР (Gentry, Lukas, 2001). Использовали проадифен вотносительно низкой концентрации 5 мкМ, при которой он действует только какблокатор канала нХР (Ryan et al., 2002), тогда как в более высоких концентрацияхпроадифен начинает действовать еще и как блокатор нХР конкурентного типа(Song, Pedersen, 2000). Последнее было бы недопустимо, поскольку проадифенблокировал бы гиперполяризацию по такому же механизму, как и другиеантагонисты специфических сайтов связывания нХР d-тубокурарин и бунгаротоксин(Krivoi etal., 2006).Судяпо опытам с регистрациейпостсинаптических ответов, проадифен в концентрации 5 мкМ не дает полногоблокирования каналов нХР (Magazanik, Vyskocil, 1976; Giniatullin et al., 1989).69Однако степень блокирования каналов проадифеном существенно возрастает придлительном присутствии агонистов рецептора.

Поэтому мы применяли 30 минпреинкубацию мышц в растворе с проадифеном.В присутствии 5 мкМ проадифена (30 мин преинкубации) начальнаядеполяризация была статистически значимо вдвое меньше (р < 0.01) посравнению с контролем, что может говорить о блокировании ~50% ионныхканалов нХР. Однако динамика и величина гиперполяризующего эффекта АХ вприсутствии проадифена не отличались от контроля (рис. 3.8).В опытах на камбаловидной мышце крысы через 15 мин действия 100 нМ АХтакже наблюдалась статистически значимая (p < 0.01) деполяризация мембранывеличиной около 2.5 мВ. К 30-й мин действия АХ наблюдалась ужегиперполяризация величиной около 4 мВ (p < 0.01), сохраняющаяся все времяприсутствия АХ в растворе (рис. 3.9).

При отмывании величина МППвозвращалась к исходному уровню (не показано).-70АХУабаинПроадифенМПП, мВ-72+ уабаин-74-76Контроль-78+ проадифен-8001530456075Время, минРис. 3.9. Динамика МПП в камбаловидной мышце крысы при действии АХ(100 нМ). Светлые кружки – нормальный физиологический раствор (контроль),средние значения МПП в 97 – 107 мышечных волокнах; темные кружки – вприсутствии 5 мкМ проадифена (30 мин преинкубации), средние значения МПП в194 – 201 мышечных волокнах; треугольники – в присутствии 100 нМ уабаина (30мин преинкубации), средние значения МПП в 80 – 100 мышечных волокнах.70Горизонтальная линия – время присутствия АХ в растворе.

Вертикальная стрелка– момент добавления уабаина или проадифена в раствор.В присутствии 5 мкМ проадифена исчезала фаза деполяризации (чтоподтверждаетрольионныхтоковчерезоткрытыеканалынХРвееформировании), но полностью сохранялась фаза гиперполяризации (рис. 3.9). Нафоне уабаина (100 нМ) фаза деполяризации сохранялась и была устойчивой весьпериод действия АХ, фаза гиперполяризации полностью отсутствовала, чтоподтверждает участие в её генерации уабаин-чувствительной 2-изоформы Na,KАТФазы.При использовании вместо АХ его негидролизуемого аналога никотина (100нМ) динамика МПП в камбаловидной мышце крысы была аналогичной (рис.3.10).

Заметим, что деполяризация была выражена намного сильнее при действииАХ, что соответствует данным о его значительно лучшей способностиактивировать нХР по сравнению с никотином (Akk, Auerbach, 1999).А-68НикотинПроадифенМПП, мВ-70-72-74-760153045607590Время, минРис. 3.10. Динамика МПП мышечных волокон камбаловидной мышцыкрысы при действии никотина в концентрации 100 нМ. Светлые кружки – вотсутствие проадифена; темные кружки – в присутствии 5 мкМ проадифена.Времяприсутствиявраствореникотинаипроадифенапоказано71соответствующими горизонтальными полосками. Средние значения МПП в болеечем 100 мышечных волокнах; по 7 мышц в каждой серии.II. Роль десенситизированного состояния никотинового рецептора вмодуляции Na,K-АТФазы.Для дальнейшего выяснения механизма взаимодействия нХР с Na,KАТФазой мы использовали локальные анестетики проадифен, QX-222 итетракаин, являющиеся также неконкурентными блокаторами ионного каналанХР (Tikhonov, Zhorov, 1998; Gentry, Lukas, 2001).