Диссертация (Роль органических кислот в механизмах устойчивости растений амаранта к действию тяжелых металлов), страница 9

Исследования, выполненные на мутантах растений табака с низкой активностьюнитратредуктазы, позволили установить, что при увеличении содержания нитрата в среде влистьяхэтихкарбоксилазы,растенийпроисходитцитозольнойпируватзначительноекиназы,увеличениецитратсинтазытранскриптовиФЭП-НАДФ-изоцитратдегидрогеназы. Увеличение уровней m-РНК сопровождалось аккумуляцией малата и цитратав листьях и корнях, что позволило предположить, что нитрат действует как сигнал,инициирующий скоординированные изменения в C и N метаболизме и продукцииорганических кислот (Scheible, 1997).1.5.2. Биосинтез и аккумуляция оксалата в растениях1.5.2.1. Содержание и формы оксалата в растенияхОксалат широко распространен в растениях и некоторые виды, особенно из семействPolygonaceae, Amaranthaceae and Chenopodiaceae могут накапливать до 3-15% оксалата всухой биомассе (Nakata, 2003; Franceschi, Nakata, 2005; Igamberdiev, Eprintsev, 2016).

Онможет присутствовать в растениях как в растворимой форме, в виде кислоты или ее K+, Na+ иотчасти Mg2+ солей, так и в виде нерастворимого оксалата кальция (Franceschi, Nakata, 2005).В листьях шпината Spinacia oleracea варьирование содержания оксалата среди 64 генотиповсоставило от 5.3% до 11.6% (Mou, 2008). Сведения о содержании оксалата у амаранта такжеразнятся. Согласно данным, полученным при анализе 30 генотипов A. cruentusи A.hypochondriacus (Gelines, Seguin, 2007) среднее содержание в них общего оксалата составляет229 мг/100г сухого вещества, или 2,29%, при этом до 80% оксалата представленонерастворимой формой.

В листьях Rumex acetosa содержание оксалата составляло от 273 до37685 мг/100г сухого вещества, увеличиваясь с возрастом листа, при этом на долю растворимойформы оксалата приходилось не более 10-15% (Tuazon-Nartea, Savage, 2013). Общаяаккумуляция оксалата в листьях растений A. cruentus в вегетативную фазу роста по данным(Musa et al., 2011) составляла 4,4% , из которых около 3,1% составлял растворимый оксалат, иэти показатели возрастали до соответственно 5,27% и 3,86% в фазу плодоношения, а уAmaranthus gangeticus L. сообщается о 9,1% оксалата в сухом веществе (Vityakon, Standal,1989).

Согласно данным (Осмоловская и др., 2007) у растений Amaranthus cruentus привыращивании в гидропонной культуре содержание нерастворимого оксалата составило 175мг-экв/100 г сухой биомассы в ювенильных листьях и возросло до 388 мг-экв в стареющемлисте, тогда как уровень водорастворимого оксалата был существенно ниже и в онтогенезелиста возрастал от 76 до 95 мг-экв/100г сухой биомассыОксалату приписывают множественную роль в растениях, включая поддержаниеосмотического потенциала и баланса неорганических катионов и анионов в клетках листа,устранение избытка или запасание кальция в клетках, защиту от насекомых (Nakata, 2003;Franceschi, Nakata, 2005; Prasad, Shivey, 2017).

Особое внимание уделяется способности рядарастений формировать кристаллы нерастворимого оксалата кальция - CaC2O4, которые могутхарактеризоваться различными соотношениями Ca2+ и оксалата (Franceschi and Nakata, 2005).В клетках разных видов растений они имеют формурафидов, друз, стилоидов, призм иликристаллического песка (Webb, 1999; Nakata, 2003) и локализованы в основном в вакуоляхспециализированных клеток - идиобластов (Franceschi, Horner, 1980; Webb, 1999; Kostman etal., 2001), но также в вакуолях клеток эпидермиса, обкладки и в ассоциации с клеточнойстенкой (Franceschi, Nakata, 2005). Отмечается, что кристаллы оксалата кальция могутприсутствовать в разных тканях растений - вегетативных, репродуктивных, запасающих,фотосинтезирующих и нефотосинтезирующих (Franceschi, Nakata, 2005).Механизмформирования кристаллов оксалата кальция до сих пор четко не определен, однакоустановлено, что они могут быть представлены в двух состояниях - как моногидрат (вевелит)или дигидрат (ведделит) (Nakata, 2003).

Моногидрат считается более стабильной химическойформой, чаще встречаемой в растениях (Webb, 1999). Оксалат, как полагают, самая сильнаякислота в растениях, он способен формировать устойчивые хелатные комплексы с Mg, Zn,Mn, Fe и другими металлами, а растворимость Na, K и Mg оксалатов состаавляет 37,0; 39,3 и1,2 г/л (Prasad, Shivay, 2017).381.5.2.2. Пути биосинтеза оксалата в растенияхПути биосинтеза оксалата в растениях дискутируются давно, однако до сих пор в этомвопросе нет единого мнения. Среди потенциально возможныхобсуждаются 4 путибиосинтеза оксалата (Franceschi, Nakata, 2005; Igamberdiev, Eprintsev, 2016) - окислениегликолата и глиоксилата при участии фермента гликолатоксидазы (Richardson, Tolbert, 1961;Nakata, 2003; Igamberdiev et al., 1988; Yu et al., 2010), расщепление L-аскорбата до оксалата итартрата (Horner et al., 2000; Kostman et al., 2001; Smirnoff et al., 2001), энзиматическоерасщепление ЩУК при участии оксалатацетазы с образованием оксалата и ацетата (Hayaishiet al., 1956; Chang, Beevers, 1968) и реакция, катализируемая изоцитратлиазой (Millerd et al.,1963).

Наличие этого фермента, катализирующего реакцию изоцитрат ↔ глиоксилат +сукцинат, было впервые показано в листьях шпината (Godavari et al., 1973).Формирование оксалата из оксалоацетата убедительно показано для микроорганизмов(Gadd, 1999), однако у высших растений присутствие ЩУК как субстрата в достаточныхколичествах не подтверждается (Xu et al., 2006), а наличие фермента оксалатацетазы,обнаруженного в грубых экстрактах из корнеплодов свеклы и листьев шпината (Chang,Beevers, 1968), не нашло подтверждений на других растительных объектах (Yu et al., 2010).Сторонники аскорбатного пути (Franceschi and Nakata, 2005; Green and Fry, 2005)отмечают, что аскорбат как субстрат широко представлен в разных тканях растений, какфотосинтезирующих, так и нефотосинтезирующих и его значение рассматривалось, вчастности, для Rumex crispus, Amaranthus retroflexus, Chenopodium album (Nuss, Loewus,1977), однако энзимы, ответственные за этот путь, до сих пор не идентифицированы(Franceschi, Nakata, 2005; Xu et al., 2006).

Так, в исследованиях, выполненных на проросткахSpinacia oleracea, листьях Begonia evansiana и некоторых видов Oxalis sp. с использованиемС14 была показана конверсия метки из аскорбата в оксалат (Yang, Loewus, 1975), а в опытах смеченым аскорбатом (Kostman et al., 2001) были приведены доказательства возможности егорасщепления с образованием оксалата в листьях Pistia strariotes, тогда как метка из гликолатаи глиоксилата не обнаруживалась в оксалате. Некоторые авторы, однако, считаютрезультаты, полученные с использованием C14 меченого аскорбата, мало доказательными (Yuet al., 2010).В настоящее время многие авторы являются сторонниками гликолатного пути синтезаоксалата, особенно у риса (Yu et al., 2010) и других C3-растений.

Гликолат можетформироваться в процессе фотодыхания (Рисунок5) в реакции, катализируемой39гликолатоксидазой (Richardson, Tolbert, 1961). Однако высокие уровни оксалата внефотосинтезирующих тканях и во многих растениях с С4 путем фотосинтеза, таких, какамарант, у которых фотодыхание минорно или отсутствует (Zindler-Frank E. 1976; Lo et al.,2000), ставят участие гликолатного пути под сомнение (Franceschi, Nakata, 2005). Кроме того,роль гликолатоксидазы в регуляции аккумуляции оксалата до конца не выяснена, в томчисле, активность и кинетические характеристики этого фермента мало отличаются уаккумулирующих и не аккумулирующих оксалат растений (Watanabe et al., 1995; Li et al.,2001-по Xu, 2006).

С другой стороны, имеются данные, что оксалат может ингибироватьактивность гликолатоксидазы, что снижает вероятность ее участия в синтезе оксалата (Xu etal., 2006). Одновременно отмечается, что гликолатоксидаза часто отсутствует в рафидпродуцирующих системах идиобластов, что ставит под сомнение функционированиегликолатного пути синтеза оксалата из гликолата фотодыхания как основного,и даетоснование предполагать участие иного, еще не идентифицированного фермента окисленияглиоксилата в оксалат (Xu et al., 2006), например, гликолатдегидрогеназы (Bari et al., 2004),метаболически связанной с восстановлением нитрата (Tian et al., 2008 -по Yu, 2010). В этойсвязи выдвигается гипотеза о возможности анаплеротического пополнения пула глиоксилата(Рисунок 5), как предшественникабиосинтеза оксалата, за счет работы глиоксилатногоцикла, в частности, у риса (Yu et al., 2010). Подтверждение этому авторы видят, с однойстороны, в возможности ап-регуляции генов ICL и MLS, кодирующих изоцитратлиазу ималатсинтазу как основные энзимы глиоксилатного цикла, а также в усилении аккумуляцииоксалата в трансгенных линиях риса со сверхэкспрессией гена ICL.Рис.

5. Гипотетический анаплеротический гликолат/глиоксилатный путь формированияоксалата. Гликолат/глиоксилат образуется при фотодыхании (красные стрелки) или можетбыть компенсирован через анаплеротические реакции, связанные с глиоксилатным циклом(синие стрелки). По (Yu et al., 2010).40Роль изоцитратлиазы, как правило, связывают с работой глиоксилатного цикла впрорастающих жиросодержащих семенах, однако цитозольная форма этого фермента былаобнаружена также в зеленых листьях, где она может участвовать в обратимой конверсии Dизоцитрата в сукцинат и глиоксилат (Igamberdiev, Eprintsev, 2016). Недавно Епринцев с соавт.(Eprintsev et al., 2015b) показали наличие в проростках амаранта Amaranthus caudatus L.,помимо Mg-активируемой глиокисомальной формы изоцитрат лиазы (ICL1), такжеMn-активируемой цитозольной формы (ICL2) с рН оптимумом 6,5, активность которой иэкспрессия соответствующего гена возрасталиу 7 дневных проростков и длительносохранялись на этом уровне.

Роль изоцитратлиазы в аккумуляции оксалата еще ранее былапоказана для Atriplex (Osmond, Avadhani, 1968). Изоцитратлиаза была также обнаружена впроростках Oxalis в отсутствии малат синтазы, что указывало на возможность ее участия вбиогенезе оксалата (Millerd et al., 1963). Предполагается, что интермедиаты дыхания могутслужить предшественниками оксалата в листьях растений (Igamberdiev, Eprintsev, 2016).Недавно свидетельства доминирующей роли изоцитратного пути в биосинтезе оксалата былиполучены для Rumex obtusifolius (Mijagi et al., 2013).

Согласно схеме, предложеннойИгамбердиевым и Епринцевым (Igamberdiev, Eprintsev, 2016), авторы не исключают наличиянескольких путей биосинтеза оксалата, хотя путь с участием цитозольной изоцитрат лиазырассматривается ими как возможно предпочтительный (Рисунок 6).Рис.6. Пути превращения оксалата в растениях. Ферменты: (1) гликолат оксидаза; (2)глиоксилат оксидаза (побочная реакция); (3) оксалат оксидаза; (4) оксалил - СоА- синтетаза;(5) оксалил-СоА-редуктаза; (6) аминотрансфераза; (7) изоцитрат лиаза; (8) оксалоацетатдекарбоксилаза; (9) аскорбатный путь; (10) глиоксилат редуктаза. Реакции 1 и 2 могуткатализироваться также лактат-дегидрогеназой. (По: Igamberdiev, Eprintsev, 2016).41Имеются данные, что аккумуляция оксалата в растениях может зависеть от некоторыхфакторов минерального питания, в том числе, регулироваться формой азота в среде.Частичное или полное замещение нитрата аммонием в питательной среде, как правило,сопровождалось снижением аккумуляции оксалата в листьях растений: на 40-50% в листьяхпортулака Portulaca oleracea (Polaniswamy, Bible, 2004) и более существенно - в листьях истеблях риса (Ji, Peng, 2005; Xu et al., 2006) и в листьях шпината (Liu et al., 2015).