Диссертация (Молекулярное моделирование механизма активации протеинкиназы А Ia), страница 5

В В-домене данная связьне реализуется, несмотря на наличие гомологичного остатка D288 [4, 5, 53].Следом за β-субдоменом, если двигаться от N-конца белка к С-концу, находится третийконсервативный участок (пурпурный на рисунке 1.2) D225 – Y244 (D349 – F374), включающий2Здесь и далее рассматривается аминокислотная последовательность А-домена RIα, а в скобках приводятсягомологичные остатки B-домена.16в себя B- и С-спирали.

У А-домена RIα в H-конформации они объединены в единую B/Cспираль, а в В-конформации расположены под углом друг к другу. В В-домене, независимо отего конформации, B- и С-спирали всегда существуют в форме отдельных спиралей [4, 6, 45].У всех цАМФ-связывающих доменов в H-конформации С-конец С-спирали удален отФСК, но в B-конформации приближается к ней и образует связи с лигандом иаминокислотнымиостаткамиβ-субдомена.Основополагающимприэтомявляетсявзаимодействие (в большинстве случаев π-электронное) между ароматическим кольцом лигандаи боковой цепью аминокислотного остатка, называемого в литературе кэпом [54]. Положениекэпа в первичной последовательности цАМФ-связывающих доменов не консервативно, ивероятно, что его функции берет на себя любой остаток, свойства которого и положение впространствеспособствуютобразованиютакоговзаимодействия.Судяподанным,приведенным в PDB и в базах первичных последовательностей, необходимыми свойствамиобладают остатки тирозина, триптофана, аргинина, пролина или лейцина.

А нужное положениев пространстве достижимо, если остаток кэпа находится на С-конце С-спирали или в началедомена, следующего за рассматриваемым. Там в В-домене RIα кэпом является остаток Сспирали Y371, а в А-домене RIα – остаток N3A-мотива В-домена W260 [6]. Тот факт, что кэп АдоменанаходитсявВ-домене,вероятно,приводиткпоявлениюположительнойкооперативности между сайтами связывания цАМФ и повышению стабильности Вконформации R-субъединицы.

Интересно, что у мутантов с делецией B-домена роль кэпа Адомена берет на себя Y244, находящийся на С-конце С-спирали [55].Четвертый консервативный участок цАМФ-связывающего домена – N3A-мотив K121 –M151 (E245 – L269) – выделен на рисунке 1.2 розовым цветом. Он состоит из N-концевой Nспирали, С-концевой А-спирали и короткого неструктурированного или несущего черты 310спирали фрагмента между ними [45]. N3A-мотив не взаимодействует напрямую с лигандами,однако по данным ЯМР анализа [56] после связывания агониста в его структуре наблюдаютсянекоторые изменения.

Несмотря на очевидное участие N3A-мотива в конформационномпереходе, у некоторых транскрипционных факторов прокариот он отсутствует, и по этойпричине N3A-мотив долго не включали в состав цАМФ-связывающих доменов. Даже впоследней версии базы данных SCOP (Structural Classification of Proteins, v1.75 от июня 2009)они отнесены к классу полностью β-белков с укладкой типа «рулет с джемом». Тем не менеетакое представление о цАМФ-связывающих доменах представляется некорректным, и висследовании, проведенном в лаборатории Сьюзен Тэйлор [45], доказано, что N3A-мотив,безусловно, является их структурным элементом.цАМФ-связывающие домены могут содержать сайты связывания различных белков.Очевидный пример этому – поверхность, формируемая А- и В-доменами R-субъединицы для17взаимодействия с C-субъединицей. Кроме того, на С-конце B-домена RIα расположен сайт длясвязывания PDZ доменов; взаимодействие с ним происходит в отсутствие цАМФ [57].Вероятно, существуют и другие сайты связывания, но о них пока известно мало.В регуляторных субъединицах протеинкиназ А два цАМФ-связывающих домена (А и В)расположены друг за другом таким образом, что в H-конформации N-спираль B-домена (Nконцевая спираль N3A-мотива) является продолжением B/C-спирали А-домена.

При связываниицАМФ оба домена переходят из H- в В-конформацию, при этом центральная «B/C/N» спиральломается на три отдельных спирали, а А- и B-домен приближаются друг к другу, формируямежду собой многочисленные контакты. Эти контакты стабилизируют цАМФ-связанную формуR-субъединицы (условно назовем ее B-конформацией R-субъединицы), не позволяя ей сноваассоциировать с С-субъединицей, пока цАМФ находится в связывающих сайтах.1.3.2 Модели конформационного перехода цАМФ-связывающих доменовРазностороннее исследование цАМФ-связывающих доменов привело к развитиюпредставлений о двух аллостерических «переключателях», благодаря которым информация освязывании цАМФ передается с β-субдомена на α-субдомен, и весь домен целикомосуществляет переход из одной конформации в другую.Первый «переключатель», электростатический, был обнаружен в А-домене RIα [5, 32].Там он представлен тремя взаимодействующими аминокислотным остатками: R209 (ФСК),D170 (β2β3-петля) и R226 (B-спираль), причем боковая цепь D170 в H-конформации связана сR226, а в В-конформации – с R209.

Модель электростатического «переключателя» полагаетначало конформационному переходу домена в изменении свойств R209 при связывании лигандаи следующем из этого «переключении» боковой цепи D170 с R226 на R209. Потеря связи междуB-спиралью и β2β3-петлей (R226 – D170) и служит механизмом передачи информации освязывании лиганда на α-субдомен. В качестве доказательств модели электростатического«переключателя» приводят дестабилизацию B-конформации у мутантов D170A3, а такжеблокированиеконформационногопереходаА-доменаантагонистомПКАRp-цАМФS,происходящее, по предположению авторов модели, из-за нарушения свойств связи Rp-цАМФS сR209 [5].

Однако ряд экспериментальных свидетельств ставит аллостерическую рольэлектростатического «переключателя» под сомнение. Во-первых, только R209 из всехаминокислотных остатков, входящих в его состав, является инвариантным, а D170 и R226 дажене консервативны [4, 15 – 23]. Во-вторых, конформационый переход цАМФ-связывающих3RIα субъединицы с мутацией D170A ассоциируют с С-субъединицей одинаково быстро, независимо от наличияцАМФ в связывающих сайтах [35].18доменов может протекать самопроизвольно [5, 30, 31], а следовательно, изменение свойств R209при связывании лиганда не должно служить его основной причиной.

И наконец в-третьих,показано, что мутационные замены D170 [32, 35, 58] не нарушают конформационного переходаА-домена RIα, а мутационные замены R209 на остатки I, T, K, S, W, N, E в разной степениухудшают активацию ПКА Iα, но не делают ее невозможной [34].Одновременно с обнаружением электростатического «переключателя», группе ХольгераРехманна на модели цАМФ-связывающего домена белка EPAC удалось показать существованиегидрофобного «переключателя» [30, 33]. В работе этого «переключателя» принимают участиедва инвариантных остатка, один из которых принадлежит ФСК (L203), а другой – B-спирали(Y229). Согласно предположению Рехманна, в основе конформационных переходов цАМФсвязывающих доменов лежит шарнирный механизм, представленный подвижным соединениемB-спирали и β-субдомена, а сам переход заключается в повороте B-спирали в рамках степенисвободы, установленной шарниром (рисунок 1.3).

В Н-конформации этот поворот заблокированположением L203, боковая цепь которого как бы упирается в ароматическое кольцо Y229. Присвязывании лиганда L203 смещается, шарнир оказывается разблокированным, и B-спиральповорачивается на заданный угол. В работах других авторов, ссылающихся на данные Рехманна[5], процессам снятия и постановки блока на шарнир дано название гидрофобного«переключателя».Модель гидрофобного «переключателя» в отличие от модели электростатического«переключателя» доказана экспериментально. Так, продемонстрировано [33], что замена L203на более объемный триптофан блокирует конформационный переход, а замены Y229 на аланини треонин, напротив, дестабилизируют H-конформацию.

Однако существующее представлениео гидрофобном «переключателе» не является полным по причине отсутствия данных омеханизме, благодаря которому связывание цАМФ приводит к смещению L203. В последнихработах предполагается [5], что гидрофобный «переключатель», помимо L203, может включатьв себя и другие гидрофобные остатки ФСК, как-то L201, I204 и А202, последний из которыхобразует водородную связь с цАМФ. Но конкретная роль этих остатков в инициацииконформационныхизмененийцАМФ-связывающихдоменоввданныхработахнерассматривается.Таким образом, процессы, запускаемые цАМФ в ФСК и β2β3-петле, и механизмы ихпередачи на α-субдомен изучены не в полной мере, и вопрос о механизме конформационныхизменений цАМФ-связывающих доменов остается на настоящий момент открытым.19А.Б.А – H-конформация; Б – B-конформация.

Рисунок взят из [30]. PBC – ФСК, hinge – шарнир, предсталенный Bспиралью, lid – C-спираль, несущая остаток кэпаРисунок 1.3 – Шарнирный механизм, лежащий в основе конформационных переходов цАМФсвязывающих доменов1.3.3. Лиганды цАМФ-связывающих доменовНесмотря на то, что в последнее время становятся известными все новые пути цАМФнезависимой активации протеинкиназы А (например, Smad3/Smad4 комплексом [12],рибосомальнойS6киназой1[11],6-бензиламинопурином[59]),единственнымиуниверсальными лигандами всех цАМФ-связывающих доменов остаются циклическиенуклеотиды. Особое место среди них занимает внутриклеточный мессенджер циклическийаденозин-3’,5’-монофосфат (цАМФ).

Его строение и нумерация атомов согласно номенклатуреIUPAC приведены на рисунке 1.4.цАМФ, безусловно, является агонистом всех цАМФ-связывающих белков, и только спротеинкиназой Г он практически не взаимодействует [60]. Остальные циклическиенуклеотиды могут с разной эффективностью быть агонистами, антагонистами и обратнымиагонистами цАМФ-связывающих белков или же вообще не иметь сродства к цАМФсвязывающим доменам. При этом действие, которое циклический нуклеотид оказывает нацАМФ-связывающий белок, зависит не только от строения циклического нуклеотида, но и отдеталей структуры связывающего сайта белка.