Автореферат (Молекулярное моделирование механизма активации протеинкиназы А Ia)

На правах рукописиРОГАЧЕВАОльга НиколаевнаМОЛЕКУЛЯРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ МЕХАНИЗМА АКТИВАЦИИПРОТЕИНКИНАЗЫ А Iα03.01.04 – биохимияАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата биологических наукСАНКТ-ПЕТЕРБУРГ2015Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетномобразовательном учреждении высшего профессионального образования«Санкт-Петербургский государственный университет»Научный руководитель:кандидат биологических наукСтефанов Василий ЕвгеньевичНаучный консультант:кандидат химических наукОфициальные оппоненты:Щеголев Борис ФедоровичРозенгарт Евгений Викторович, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение наукиИнститут физиологии и биохимии им.

И. М. Сеченова Российской академии наук, руководительгруппы функциональной биохимии беспозвоночных.Петухов Михаил Геннадьевич, доктор физикоматематических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение Петербургскийинститут ядерной физики им. Б. П. Константинова, Национальный исследовательский центр"Курчатовский институт", ведущий научныйсотрудникотделениямолекулярнойирадиационной биофизики.Ведущее научное учреждение: Федеральное государственное бюджетноеучреждение науки Институт цитологии Российской академии наук.Защита состоится 14 мая 2015 г.

вчасов на заседанииДиссертационного совета Д 212.232.10 при Федеральном государственномбюджетном образовательном учреждении высшего профессиональногообразования «Санкт-Петербургский государственный университет» поадресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд. 90.С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. А. М.

Горького Федерального государственного бюджетного образовательногоучреждениявысшегопрофессиональногообразования«СанктПетербургский государственный университет» (г. Санкт-Петербург,Университетская наб., 7/9) и на сайте www.spb.ru.Автореферат разослан«» апреля 2015 г.Ученый секретарь Диссертационного совета,доктор биологических наукЛяксо Елена Евгеньевна3ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность темы исследования.

Протеинкиназа А (ПКА) – ключевойбелок множества сигнальных каскадов. Ее ферментативную активностьобеспечивают каталитические субъединицы (С-субъединицы), а неактивноесостояние C-субъединиц достигается путем образования комплексов с рядомпептидов и белков. Наиболее изученными и, видимо, наиболеераспространенными являются RC комплексы – комплексы С-субъединиц сбелками, известными как регуляторные субъединицы ПКА (R-субъединицы).RC комплекс, образованный с участием RIα изоформы R-субъединицы, носитназвание ПКА Iα.Важное свойство всех RC комплексов состоит в том, что онидиссоциируют в присутствии внутриклеточного мессенджера циклическогоаденозин-3':5'-монофосфата (цАМФ) на свободные R- и С-субъединицы, чтоприводит к активации ПКА. Причина цАМФ-зависимой диссоциации RCкомплексов заключается в том, что в состав всех изоформ R-субъединиц входятдва цАМФ-связывающих домена (А-домен и B-домен), каждый из которыхможет существовать в двух конечных конформациях: цАМФ-связанной Bконформации и реализующейся в составе RC комплекса H-конформации.

Присвязывании цАМФ оба домена претерпевают переход из H- в В-конформацию,благодаря чему контакты между R- и С-субъединицами ослабевают. Пониманиемеханизма конформационных изменений цАМФ-связывающих доменов важнодля решения ряда биологических задач.Так, циклические нуклеотиды играют ключевую роль в терапииразличных заболеваний. Известно, что аналог цАМФ, Rp-цАМФS1, и егопроизводные являются эффективными ингибиторами ПКА Iα, а следовательномогут использоваться для лечения патологических состояний, при которыхпуть цАМФ/ПКА Iα гиперактивирован.

Одним из примеров таких состоянийявляются ВИЧ-инфекции. В данном случае гиперактивация ПКА Iα приводит кугнетению T-клеточного ответа, а введение Rp-цАМФS и его производныхвосстанавливает пролиферацию T-клеток. Понимание процесса цАМФиндуцированной активации ПКА Iα могло бы не только ускорить получениеклинического препарата, но и позволило бы сделать его максимальноэффективным.Кроме того, известно, что RIα субъединица, помимо поддержаниянеактивного состояния ПКА, участвует в инактивации цитохромоксидазы,образует комплексы с mTOR киназой, рибосомальной S6 киназой 1 (RSK1) иSmad3/Smad4 комплексом, контролирует транспорт факторов транскрипции(PATZ1) и репликации (RFC40) в ядро, причем некоторые из этих процессов1Rp-цАМФS (обратный агонист) и Sp-цАМФS (агонист) – серузамещенные аналоги цАМФ.Атомом серы замещены соответственно экваториальный или аксиальный экзоциклическиеатомы кислорода.4регулируются цАМФ.

Установление механизма конформационных переходовR-субъединицы лежит в основе описания структуры и объясненияфункционирования этих белковых комплексов, а также прогнозированиявзаимодействия R-субъединицы с другими белками.Наконец, цАМФ-связывающие и родственные им домены широкопредставлены в протеомах разнообразных организмов.

Они входят в составтранскрипционных факторов прокариот (в том числе активируемых ненуклеотидами), HCN каналов (собственно HCN и spIH), CNG каналов, белковEPAC, протеинкиназ А и Г. Описание конформационного перехода любого изэтих доменов существенно для понимания функционирования всех названныхбелков, а также для решения практических задач, связанных с регуляцией ихактивности.На сегодняшний день расшифрованы кристаллические структуры цАМФи Rp-цАМФS-связанных R-субъединиц (в том числе и отдельного цАМФ- и RpцАМФS-связанного А-домена RIα), свободного А-домена RIα и каталитическинеактивного комплекса R- и С-субъединиц. Методом ЯМР продемонстрировано,что изолированные цАМФ-связывающие домены в отсутствие внешнихфакторов находятся в состоянии динамического равновесия между H- и Вконформациями. Способность ряда белков и низкомолекулярных соединений (втом числе цАМФ) влиять на положение искомого равновесия и скорость егодостижения лежит в основе выполнения всех биологических функций цАМФсвязывающих доменов.Для объяснения механизма перехода этих доменов (и в частности Адомена RIα) из одной конформации в другую были предложены модели двух«переключателей»: электростатического (R209–D170–R226) и гидрофобного(L203–Y229).Модельгидрофобного«переключателя»подтвержденаэкспериментально, но остается неизвестным механизм, посредством которогоэтот «переключатель» приводится в действие связыванием цАМФ.

Модельэлектростатического «переключателя», напротив, объясняет, каким образоминформация о связывании цАМФ передается за пределы цАМФ-связывающегосайта, однако логике этой модели противоречит факт активации ПКА смутационными заменами R209 и D170.Методы молекулярного моделирования являются перспективнымподходом исследования конформационных переходов белков.

Тем не менее этиметоды ни разу не были применены для подтверждения моделейэлектростатического и гидрофобного «переключателей». А единственнаяпопытка показать конформационный переход цАМФ-связывающего домена непринесла желаемого результата, так как белок все время моделированияоставался вблизи исходного энергетического минимума.Цель работы. Для объяснения механизма активации ПКА прежде всегонадо расшифровать механизм перехода А-домена RIα из H- в В-конформацию,что и стало целью работы. В рамках поставленной цели были выделеныследующие задачи, решаемые методами молекулярного моделирования.5Задачи исследования:1) расшифровать механизм, посредством которого связывание цАМФзапускает конформационный переход А-домена RIα;2) определить роль электростатического «переключателя» R209–D170–R226 в конформационном переходе А-домена RIα;3) установить роль гидрофобного «переключателя» L203–Y229 вконформационном переходе А-домена RIα;4) описать наиболее вероятный путь перехода А-домена RIα из H- в Вконформацию.Методологическая основа исследования.

При работе над диссертациейприменялась совокупность методов молекулярного моделирования. Основныерезультатыбылиполученыметодамимолекулярнойдинамики.Вспомогательную роль играли квантово-химические расчеты и лигандбелковый докинг.Научная новизна работы. В диссертации впервые расшифрованы всеэтапы механизма перехода А-домена RIα из H- в B-конформацию и предложенамодельэлектростатического«переключателя»цАМФ(O6)–A202(N-H)–G199(C=O), посредством которого цАМФ передает информацию о своемсвязывании на гидрофобный «переключатель» L203–Y229 и этим запускаетконформационный переход А-домена.

Подтверждена и дополненасуществующая модель гидрофобного «переключателя» L203–Y229. Впервыеустановлено, что движущей силой поворота B/C-спирали, происходящего приего переключении, является на первых этапах сохранение взаимодействиямежду Y229 и L203, а затем повышение энергии взаимодействия Y229 с βсубдоменом в целом. Впервые показано, что для функционированиягидрофобного «переключателя» в А-домене RIα необходимо смещение N3Aмотива. Продемонстрировано, что инвариантность остатка аргинина вположении 209 не связана с его участием в электростатическом«переключателе» R209–D170–R226, а определяется рядом других функций.Основные положения, выносимые на защиту:1) цАМФ запускает переход А-домена регуляторной субъединицыПКА Iα из H- в В-конформацию посредством электростатического«переключателя» цАМФ(O6)–A202(N-H)–G199(C=O), передающего информацию о связывании цАМФ на гидрофобный «переключатель» L203–Y229.2) В переходе А-домена регуляторной субъединицы ПКА Iα из H- в Вконформацию не задействован электростатический «переключатель» R209–D170–R226.

Однако аминокислотный остаток в положении 209 выполняет рядважных функций, как-то: (а) фиксация лиганда в связывающем сайте; (б)поддержание конформации β2β3-петли; (в) создание стерически благоприятныхусловий для размещения A202 в положении, характерном для B-конформации,и стабилизация этого положения путем образования взаимодействия с боковойцепью A202. Аргинин в положении 209 наилучшим образом совмещает6выполнение всех перечисленных функций, что является причиной егоинвариантности во всех цАМФ-связывающих доменах.3) Переход А-домена регуляторной субъединицы ПКА Iα из H- в Вконформацию происходит в три последовательных этапа.