Автореферат (1145985), страница 3
Текст из файла (страница 3)
В результате остаток A202 смещается, связьA202(N-H)–G199(O) разрушается, и спираль ФСК переходит из 310- в α-форму.Достигнутое положение спирали ФСК закрепляется образованием водороднойсвязи A202(O)–T207(N-H). Разрыв и образование указанных связей показан нарисунке 1.А.Б.А – H-конформация; Б – B-конформация.Рисунок 1 – цАМФ-связывающий сайт А-домена RIα, представленныйфосфат-связывающей кассетой (ФСК)2) Rp-цАМФS препятствует смещению амидной группы A202, чтоследует из установленной в главе 3 длины водородной связи между атомомсеры Rp-цАМФS и амидной группой белка, а также обнаруженных методомдокинга различий в положениях Rp-цАМФS и цАМФ в связывающем сайте Адомена.
В таком случае поведение Rp-цАМФS как обратного агониста10подтверждает ключевую роль смещения амидной группы A202 при переходе Адомена из H- в В-конформацию.3) переход 310-спирали ФСК в α-форму приводит к смещению остаткаL203 и «упаковыванию» его боковой цепи в гидрофобный карман,образованный β2β3-петлей. В соответствии с литературными данными этособытие является начальной стадией работы гидрофобного «переключателя»L203–Y229.4) в В-конформации образуется ионная связь между боковыми цепямиD170 и R209. Однако активное участие электростатического «переключателя»R209–D170–R226 в конформационном переходе А-домена проведенные намирасчеты не подтверждают.Динамика β-субдомена белка дикого типа и с мутационнымизаменами остатка R209. С использованием кластерного анализа выявленошесть конформаций, принимаемых β-субдоменом: B, B1, B2 и B3 –конформации B-типа и H, H1 – конформации H-типа.
Две из них, а именно H иB, характерны для любого цАМФ-связывающего домена, независимо отмутаций в β-субдомене и присутствия α-субдомена. Показано, что природаостатка в положении 209 и лиганд в связывающем сайте не оказывают влиянияна структуру выявленных конформаций, однако сказываются на ихзаселенности. Соотношение конформаций для разных β-субдоменовсоставляет:1) β-субдомен белка дикого типа (+цАМФ): B – 25%, B2 – 74% и H – 1%.2) β-субдомен белка дикого типа (-цАМФ): B – 16%, B2 – 79% и H – 5%.3) R209I (+цАМФ): B – 54%, B2 – 43% и H – 3%.4) R209E (–цАМФ): B – 39%, B1 – 6%, B2 – 7%, H – 48%.5) R209G (–цАМФ): B – 26%, B1 – 8%, B2 – 22%, H – 44%.6) R209K (–цАМФ): B – 14%, B1 – 12%, B2 – 24%, H1 – 22%, H – 28%.7) R209K (+цАМФ): B – следовые количества, B2 – 72%, H – 28%.8) R209K2 (+цАМФ): B – 13%, B3 – 40%, B2 – 47%.На основании полученных данных сделаны следующие выводы:1) B-конформация β-субдомена выгодней H-конформации примерно на2,9 кДж/моль.
Это отличает β-субдомен от целого А-домена, у которогосвободные энергии образования этих конформаций примерно равны, исвидетельствует в пользу участия α-субдомена в смещении равновесия всторону H-конформации. Тем не менее это влияние умеренно, и β-субдоменможет быть использован в качестве модели для изучения конформационнойдинамики соответствующего цАМФ-связывающего домена.2) электростатический «переключатель» R209–D170–R226 не задействован в конформационном переходе А-домена из H- в В-конформацию. В пользу2В этом эксперименте положение боковой цепи K209 поддерживалось близким к нативномуположению боковой цепи R209 при помощи наложения внешних сил.11отсутствия у него такой функции свидетельствуют: а) переход в Вконформацию домена с мутационной заменой R209I; б) восстановлениеспособности домена с мутацией R209K к H→B конформационному переходукак результат фиксации положения β2β3-петли и боковой цепи K209.
Согласнонашим представлениям роль электростатического «переключателя» R209–D170–R226 сводится к дополнительной стабилизации B- и Н-конформаций Адомена с помощью водородных связей R209–D170 и R226–D170соответственно.3) остаток в положении 209 выполняет ряд важных функций, не связанных с его участием в электростатическом «переключателе» R209–D170–R226. Кэтим функциям относятся: (а) фиксация лиганда в связывающем сайте; (б)поддержание конформации β2β3-петли; (в) создание стерически благоприятныхусловий для размещения A202 в положении, характерном для B-конформации,и стабилизация этого положения путем образования взаимодействия междубоковыми цепями A202 и R209. R209 наилучшим образом совмещаетвыполнение всех перечисленных функций, что способствует появлениюустойчивого энергетического минимума, соответствующего B-конформации.Другие рассмотренные нами остатки оказываются неспособными квыполнению той или иной из обозначенных функций, вследствие чего Bконформация становится менее устойчивой.
Сила их дестабилизирующеговлияния на B-конформацию в присутствии цАМФ увеличивается в рядуI<K<E(G), а в отсутствие цАМФ – в ряду I<E<G<K. Сопоставление этих рядовс экспериментальными данными по активации ПКА Iα дает основание полагать,что склонность к формированию B-конформации определяет биологическикорректное функционирование как отдельных цАМФ-связывающих доменов,так и целого белка.Механизм перехода А-домена RIαα из H- в В-конформацию. На основании данных, полученных методом молекулярной динамики и обработанных спомощью факторного и кросскорреляционного анализов, предложена схеманаиболее вероятного пути перехода А-домена из H- в В-конформацию,представленная в виде частично детерминированной последовательностивыделенных нами событий: 1) Б, 2) В1, Г1, 3) Д, 4) Г2[В2], Е, 5) И.Очередности пунктов приведенной схемы соответствует реализацияпроцесса конформационного перехода во времени.
События, указанные водном пункте, могут наступать в произвольной последовательности, в томчисле одно на фоне другого. Напротив, для событий, указанных в разныхпунктах, действует определенный порядок: каждое из событий последующегопункта может наступать одновременно с событиями предыдущего пункта, но неранее их.Событие Б (рисунок 2) представляет собой переход ФСК из H- в Вконформацию, включая упаковывание боковой цепи L203 в гидрофобныйкарман. Главным участникам этого события: амидной группе A202,12карбонильной группе G199 и экваториальному атому кислорода лиганда – мыдали название электростатического «переключателя» цАМФ(O6)–A202(N-H)–G199(C=O).
Посредством этого «переключателя» цАМФ передает информациюо своем связывании на гидрофобный «переключатель» L203–Y229 и запускаеттаким образом конформационный переход А-домена.Событие В (рисунок 3) заключается в смещении N3A-мотива в сторону отФСК, событие Г – в повороте B/C-спирали (рисунок 4), а событие Д – вувеличении энергии взаимодействия остатка Y229 с β-субдоменом (рисунок 4).События В и Г, вследствие большой длительности, имеют тенденциюосуществляться в два этапа, для указания на которые введены метки "1" и "2".На втором этапе протекание события Г определяется событием В, чтообозначено как Г2[В2].А.Б.А – H-конформация; Б – B-конформация.
Лентой оранжевого цвета выделена ФСК, лентойфиолетового цвета – β2β3-петля. Лиганд не показан.Рисунок 2 – Событие Б. Переход ФСК в В-конформациюА.Б.А – H-конформация; Б – B-конформация. Лентой желтого цвета выделена ФСК, фиолетового– β2β3-петля, розового – N3A-мотив, пурпурного – фрагмент B/C-спирали. Стрелкой указанонаправление смещения N3A-мотива.Рисунок 3 – Событие В. Смещение N3A-мотива от ФСК13А.Б.А – H-конформация; Б – конформация, реализовавшаяся после завершения событий Г и Д.Цветовые обозначения надвторичных структур А-домена те же, что и на рисунке 3.Рисунок 4 – События Г и Д.
Поворот B/С-спирали и увеличение энергиивзаимодействия остатка Y229 с β-субдоменомСовокупность событий Б, Г1 и Д соответствует переключениюгидрофобного «переключателя» L203–Y229 в состояние, характерное для Bконформации, что подтверждает его ключевую роль в конформационномпереходе А-домена. Тем не менее существующая модель гидрофобного«переключателя» не является полной. На основании данных, полученных входе моделирования, мы внесли в нее следующие дополнения:1) смещение боковой цепи L203 происходит вследствие переключениявзаимодействий в описанном нами электростатическом «переключателе»цАМФ(O6)–A202(N-H)–G199(C=O);2) движущей силой поворота B/C-спирали является на первых этапахсохранение взаимодействия между остатками Y229 и L203, а затем повышениеэнергии взаимодействия остатка Y229 с β-субдоменом в целом;3) частичное смещение N3A-мотива по направлению от ФСК являетсяобязательным условием поворота B/C-спирали, без выполнения которогоснятие блока с гидрофобного «переключателя» не является полным.
Этодополнение справедливо для всех цАМФ-связывающих доменов, кромедоменов белка EPAC, у которых N3A-мотив в H- и В-конформации занимаетодно и то же положение относительно ФСК и не блокирует поворот B/Cспирали.Завершающие переход события Е и И специфичны для А-доменовпротеинкиназ А и B-доменов белков EPAC. В основе события Е (рисунок 5)лежит переход фрагмента B/С-спирали из α- в π-форму, сопровождаемыйповоротом боковой цепи L233 к N3A-мотиву, а боковой цепи M234 к ФСК, чтоприводит к увеличению энергии взаимодействия между этими структурами.Событие И (рисунок 6) заключается в образовании излома B/C-спирали наместе фрагмента π-спирали, а также в фиксации этого излома с помощьюэлектростатического взаимодействия R241–E200 и в меньшей степени –вандерваальсового взаимодействия L238–I204.14А.Б.А – фрагмент А-домена перед совершением события Е; Б – фрагмент А-домена послесовершения события Е. Серым цветом выделен виток B/C-спирали, претерпевающийпереход в π-форму.
Остальные обозначения те же, что и на рисунке 3.Рисунок 5 – Событие Е. Переход фрагмента B/C-спирали в π-формуА.Б.А – А-домен перед совершением события И; Б – А-домен после совершения события И (Bконформация). Лентой бирюзового цвета показана часть β-субдомена, не участвующая вH↔B переходе. Остальные обозначения те же, что и на рисунке 3.Рисунок 6 – Событие И.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
