Автореферат (1145985), страница 2
Текст из файла (страница 2)
На первом этапе вответ на связывание лиганда B-конформацию принимает фосфат-связывающаякассета. На втором этапе происходит смещение N3A-мотива, поворот B/Cспирали и формирование в ее структуре витка π-спирали. На третьем,заключительном, этапе на месте витка π-спирали образуется излом, которыйразделяет B/C-спираль на отдельные B- и С-спирали.Теоретическая и практическая значимость работы. Результатынастоящего исследования важны для фундаментальной биохимии, так как ониобъясняют механизм конформационного перехода А-домена RIα какпредставителя большого семейства цАМФ-связывающих и родственных имдоменов.
Практическая значимость работы связана с тем, что белки,содержащие эти домены, выполняют важные функции в клетках, и изменениеих активности часто сопровождает собой патологические состояния илиприводит к ним. В этой связи полученные данные могут быть использованы длянаправленного поиска новых эффективных блокаторов и активаторов цАМФсвязывающих белков для дальнейшего их использования в медицине.Апробация результатов исследования.
Материалы диссертации былипредставлены на следующих конференциях: Политехнический симпозиум«Молодые Ученые – промышленности Северо-Западного региона» (СанктПетербург, 2006); Двенадцатая Санкт-Петербургская ассамблея молодыхученых и специалистов (Санкт-Петербург, 2007); The Second Saint-PetersburgInternational Conference on NanoBioTechnologies NanoBio`08 (St.
Petersburg,2008); Научное наследие академика Л. А. Орбели. Структурные ифункциональные основы эволюции функций, физиологии экстремальныхсостояний. Всероссийская конференция, посвященная 125-летию со днярождения академика Л. А. Орбели (Санкт-Петербург, 2008); Тринадцатая СанктПетербургская ассамблея молодых ученых и специалистов (Санкт-Петербург,2008); 6-ая Всероссийская конференция «Молекулярное моделирование»(Москва, 2009); Moscow conference on computational molecular biologyMCCMB`09 (Moscow, 2009); «Современная химическая физика» XXIсимпозиум (Москва–Туапсе, 2009); Third International NanoBio Conference(Zurich, 2010); XXI Съезд Физиологического общества имени И. П. Павлова(Москва–Калуга, 2010); Пятнадцатая Санкт-Петербургская ассамблея молодыхученых и специалистов (Санкт-Петербург, 2010); 7-ая Всероссийскаяконференция «Молекулярное моделирование» (Москва, 2011); ПерваяМеждународная Интернет-конференция «Математическое и компьютерноемоделирование в биологии и химии.
Перспективы развития» (Казань, 2012);Международная конференция «Биология – наука XXI века» (Москва, 2012); TheFirst International Conference «Quantitative imaging and spectroscopy inneuroscience» (St. Petersburg, 2012); FEBS Congress (St. Petersburg, 2013);7Moscow conference on computational molecular biology MCCMB`13 (Moscow,2013).Публикации. Результаты диссертации опубликованы в 22 работах, в томчисле в 5 статьях, 4 из которых опубликованы в журналах по перечню ВАК РФ.Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения,шести глав, заключения, выводов, списка литературы и трех приложений (А, Би В). Работа изложена на 141 странице печатного текста, содержит 7 таблиц ииллюстрирована 21 рисунком. В списке цитируемой литературы приведено 112источников.ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫМатериалы и методыВсе расчеты проводились на основе структур цАМФ-связывающихдоменов, полученных методом рентгеноструктурного анализа и доступных вбазе PDB.
H-конформация: А-домен – 3FHI (для докинга) и 3PVB (длямоделирования), B-домен – 2QCS с обратной мутацией K333R, возвращающейдикий фенотип. B-конформация: оба домена – 1NE6.Докинг лигандов цАМФ, Rp-цАМФS и Sp-цАМФS осуществлялся всвязывающие сайты обоих доменов в обеих конформациях с помощьюпрограммы Quantum 3.3.0. Квантово-химические расчеты были проведены сиспользованием пакета программ Gaussian методом Хартри–Фока–Рутаана вбазисе 6-31+G(d), без учета влияния среды, T= 0 K.Моделирования методом молекулярной динамики (МД) проводились сиспользованием программы NAMD при следующих условиях: силовое полеCHARMM27, периодические граничные условия, водная среда, учетэлектростатики методом PME (Particle Mesh Ewald). Нативное положение β2β3петли во всех моделированиях поддерживалось при помощи наложениявнешних сил.Динамика β-субдоменов белка дикого типа (в присутствии и отсутствиецАМФ) и с мутационными заменами R209I, R209E, R209G, R209Kисследовалась в NVE ансамбле при средней температуре около 310 K.
Отказ отучета α-субдомена был вызван необходимостью уменьшить время расчетов.Длительность траекторий для каждой из рассматриваемых систем составила 80– 150 нс. Для выявления отдельных конформаций β-субдомена было отобрановосемь коллективных переменных. По ним проводилась кластеризация.Для моделирования перехода А-домена из H- в В-конформацию былапредложена оригинальная методика.
На первом этапе комплекс,представляющий собой А-домен в H-конформации с цАМФ в связывающемсайте, нагревался до температуры близкой к 350 K, а затем моделировался вNVE ансамбле до перехода цАМФ-связывающего сайта, представленногофосфат-связывающей кассетой (ФСК), в В-конформацию. На втором этапеметодом классической МД моделировались события, относящиеся к работе8гидрофобного «переключателя». Как только последние можно было считатьсовершившимися, начинался третий этап моделирования, отличающийся отвторого применением ускоренной МД. Цель этого этапа состояла в полученииπ-спирального фрагмента в составе B/C-спирали.
Четвертый этапмоделирования проводился методом классической МД и длился до тех пор,пока на границе B- и С-спиралей не начинал формироваться излом. Передпятым этапом моделирования мы производили мутационные замены K240A иR239A, устраняющие препятствия к быстрому переходу А-домена в Вконформацию. Моделирование на этом этапе также осуществлялось методомклассической МД. Последние четыре этапа моделирования были предприняты вNVT ансамбле при температуре 300 K, поддерживаемой постоянной сиспользованием динамики Ланжевена. Всего было получено тринадцатьтраекторий – путей перехода А-домена из H- в В-конформацию (из нихдвенадцать для домена белка дикого типа и одна для домена с мутационнойзаменой R209K).
В рамках предложенной методики среднее время перехода Адомена из H- в В-конформацию составляло приблизительно 30 нс. Дляописания механизма этого перехода было отобрано двадцать шестьколлективных переменных. Их изменения во времени исследовалисьпоследовательно методами факторного и кросскорреляционного анализов.Результаты и обсужденияАнализ взаимодействия лигандов со связывающими сайтами А- и Bдоменов ПКА Iαα. В соответствии с предпринятыми исследованиями былоустановлено, что:1) цАМФ-связывающий сайт А-домена RIα доступен для лигандов, дажеесли R-субъединица связана с С-субъединицей. цАМФ, Sp-цАМФS и RpцАМФS связываются с цАМФ-связывающими доменами, находящимися как вВ-, так и в H-конформации, причем комплексы всех названных лигандов сдоменами в B-конформации характеризуются большей устойчивостью.
Этотфакт (в совокупности с тем, что в RC комплексе А-домен находится в Hконформации) говорит в пользу преимущественного протекания активацииПКА Iα по пути индуцированного соответствия. Механизм обратного агонизмаRp-цАМФS при этом должен заключаться в блокировании перехода А-доменаиз H- в В-конформацию.2) при связывании лигандов с А-доменом, находящимся в H-конформации, реализуются все водородные связи, известные по данным рентгеноструктурного анализа, кроме связи между экзоциклическим экваториальныматомом лиганда и амидной группой A202.
Причина отсутствия этой связизаключается в большом расстоянии между участвующими в ее образованиитяжелыми атомами. На этом основании предложено, что именно смещениеамидной группы A202 должно приводить к изменению структуры ФСК, аследовательно запускать конформационный переход всего домена. Возможный9механизм обратного агонизма Rp-цАМФS лежит в создании препятствиясмещению данной амидной группы.3) для водородной связи между экзоциклическим атомом кислородацАМФ и амидной группой белка характерны энергия –7,7 ккал/моль и длина3,0 Ǻ (данные квантово-химических расчетов). Rp-цАМФS образует аналогичную водородную связь, энергия которой –4,7 ккал/моль, а длина 3,9 Ǻ.Моделирование перехода β-субдомена А-домена из H- в В-конформацию.
По результатам исследования показано, что:1) амидная группа А202 в Н-конформации входит в остов 310-спиралиФСК и образует водородную связь с карбонильной группой G199. При этом порезультатам докинга расстояние между атомом азота амидной группы A202 иэкзоциклическим экваториальным атомом кислорода цАМФ составляет ~5,2 Ǻ.Переход в В-конформацию инициируется процессом образования водороднойсвязи с участием этих двух атомов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
