Отзыв официального оппонента (Молекулярно–генетические и клеточные механизмы дифференцировки симбиотического клубенька)

Впечатляет активность автора на международных конференциях, где материалы диссертации были доложены (перечислены 12 международных конгрессов), а также привлеченное финансирование и количество выполненных соискателем проектов, поддержанных 43 грантами. Обзор литературы очень подробен и обстоятелен, подразделен на два неравноценных раздела и собственное заключение. Первый раздел занимает 124 страницы, содержит до трех дополнительных уровней рубрикации и посвящен развитию и функционированию симбиотического клубенька; тема раскрыта подробно и всесторонне.

Второй раздел занимает 14 станиц и посвящен влиянию на развитие клубеньков абиотических стрессов. Набор рассмотренных стрессовых факторов довольно узок (ровно два) и отражает особенности данной работы, Два подраздела посвящены кадмию, третий — уплотнению почвы. Важность вреда кадмия как токсического тяжелого металла обоснована, но вне контекста сравнения с вредом других тяжелых металлов и прочих вредоносных веществ антропического происхождения, что несколько снижает убедительность такого выбора. Заключение к обзору литературы включает 5 страниц и в сжатой форме дает общее представление о проблематике в области генетики, цитологии, молекулярной и клеточной биологии в контексте поставленных в настоящей работе целей и задач. Материалы и методы описаны подробно и тщательно.

Не очень понятно употребление слова «методики», к тому же употребленного с опечаткой, вместо общепринятого «методы». В работе использована впечатляющая панель из 32 мутантов гороха по признакам азотфиксации, как отмечает автор — самая представительная в мире. Два таких мутанта получены самим автором. Использование шести генетически модифицированных штаммов симбиотических бактерий, содержащих репортерные и гибридные гены, существенно расширили возможности цитобиохимических исследований автора. Применен широкий спектр методов гистохимии, световой, лазерной сканирующей конфокальной и просвечивающей электронной микроскопии, включая иммунолокализацию с использованием 12 различных антител и гистохимическое выявление суберина, каллозы и пероксида водорода. Применялись методы клонирования фрагментов ДНК в бактериях; такие молекулярные методы, как полимеразная цепная реакция, в том числе аллель-зависимая и ПЦР в реальном времени.

Общее количество использованных в работе праймеров составило ни больше ни меньше как 79, в том числе один меченый радиоактивным изотопом '~Р. Применялась лазерная миродиссекция с последующим выделением РНК и синтезом кДНК, различные методы количественного анализа фитогормонов и продуктов экспрессии генов, в том числе репортерных. Таким образом, в работе применен самый широкий набор высокотехнологичных современных методов экспериментального исследования. В части исследования, посвященной поиску у гороха новых мутаций по фенотипам, связанным с нарушениями формирования и функциональности клубеньков, проделана большая работа по скринингу 2069 растений второго поколения, происходящих от 425 семян, подвергнутых обработке химическим мутагеном. Было выделено 15 мутантов, неспособных формировать клубеньки или формирующие единичные клубеньки, 30 мутантов, формирующих нефункциональные клубеньки ~при этом суперклубеньвых мутантов получено не было).

Скрещивание растений пятого поколения на исходную линию дало начало шести мутантным линиям. Эти линии, а также четыре линии, выявленные ранее коллегами из того же коллектива, общим числом 17, были подвергнуты тестам на аллелизм. Среди них обнаружились мутации, аллельные 8 ранее выявленным генам, а один из мутантов позволил выявить ранее неизвестный локус, обозначенный как Рюьут42. Автором затронут интересный вопрос о генотипической специфичности химического мутагенеза, отмечена высокая эффективность линии ЯбЕ в качестве исходной для экспериментов по индукции симбиотических мутаций. Не исключено, что это каким-то образом связано с тем, что в родословной данной линии имеются в том числе и дикие представители вида посевной горох.

Автор делает заключение, что выявление локусов генома гороха, влияющих на клубенькообразование и симбиогенез, близко к завершению и что число таких локусов вряд ли существенно превышает 40, В опытах по генетическому картированию уточнена хромосомная локализация ранее известного л оку с а Рыут31 и при этом была существенно уточнена карта группы сцепления Ш, а локусы Рыут33 и Рыуп~38 были впервые локализованы в группах сцепления Ч и 1, соответственно. Анализ широкой панели мутантов позволил выявить серию локусов гороха, участвующих в начальной стадии бактериальной инфекции и органогенеза клубенька, порядок их участия в генетической сети контроля данных процессов на этой стадии и характер аномалий фенотипа при исключении функций каждого из них.

Выявлены ключевые точки взаимного контроля генетических программ начальных стадий инфекции (выявлены три такие точки) и органогенеза 1одна такая точка). На основании своего фенотипического проявления ген Рькут35 гороха был идентифицирован в качестве ортолога гена АуЛЧЖ японского лядвенцапервого среди генов симбиоегеза бобовых растений с выясненной первичной структурой — и просеквенирован, Симбиотический клубенек является специализированным органом растения, предназначенным для взаимодейсвтия с симбиотическими бактериями и их «культивирования», поэтому генетические и биохимические механизмы его формирования не менее важны, чем морфогенез «традиционных» вегетативных и генеративных органов растения. В данной работе эти механизмы изучались на глубинном уровне распределения и влияния таких важных веществ как арабиногалактанпротеин-экстензинов, пероксида водорода, этилена, нитратов, анализа реорганизация тубули нового цитоскелета, с применением совеменных биохимических и микроскопических методов, Так, было показано, что пероксид водорода не только принимает участие в защитных реакциях, но и является необходимым компонентом при созревании инфекционных нитей в ходе дифференцировки клубенька.

Была выявлена ведущая роль микротрубочек в росте и функционировании инфекционных нитей и капель. В этой части работы получены свидетельства в пользу гипотезы о существовании общей генетической программы, участвующей в формировании арбускулярномикоризного и бобово-ризобиального симбиоза, которая первоначально возникла в контексте эволюционного формирования арбускулярной микоризы, свойственной большинству растений, и впоследствии была рекрутирована в ходе эволюционно более позднего возникновения ризобиального симбиоза, характерного только для бобовых растений. Были получены свидетельства, что этилен контролирует развитие клубеньков на различных стадиях, в том числе что он, вероятно, контролирует активность меристемы в зрелом клубеньке. Сравнительный генетический анализ развития детерминированных клубеньков лядвенца японского и недетерминированных клубеньков гороха посевного показал, что некоторые мутации, приводящие к неэффективному симбиозу, влияют на ингибирующий эффект нитратов на клубенькообразование, что указывает на связь этого процесса с дифференцировкой бактероидов.

В исследоваиях бактериального симбионта было показано, что экспрессия его генов постепенно уменьшается в ходе дифференцировки бактероидов, за исключением симбиотических генов, регулируемых кислородом, при этом наибольшая репрессия достигается только в азотфиксирующих, органеллоподобных бактероидах, утративших способность к свободноживущему росту.

Некоторые мутации гороха, контролирующие поздние стадии развития симбиоза, приводят к индукции специфических защитных реакций, то есть бактериальный симбионт в некотором смысле воспринимается растением как патоген, и растение контролирует микросимбионта в течение всего существования клубенька. Показано, что в клубеньках мутантов, у которых развитие клубеньков блокировано, активируются гены, связанные со старением, и что старение является общим ответом на неэффективность клубенька любой природы.

Показано, что кадмий влияет не только на общее развитие растений, но и препятствует развитию и функционированию симбиотических клубеньков. Полученный в работе мутант гороха ЯОЕСй обладает как повышенной устойчивостью к кадмию, так и накопливает его в тканях растения; при этом учтойчивость наблюдается и на уровне формирования и функционирования клубеньков. Также в работе были созданы два штамма клубеньковых бактерий гороха (3841-РзМТ! и 3841-РзМТ2), содержащие кодирующие области растительных генов РиМТ! и РиМТ2, слитые с промоторной областью ризобиального гена п(Щ.; инокуляция этими штаммами увеличивала содержание кадмия в корнях, клубеньках и стеблях растений. Эти и подобные им мутации макросимбионта и трансгенные штаммы микросимбионта могут быть использованы на практике для биологического улучшения почв, загрязненных тяжелыми металлами.

По результатам столь объемной и многогранной диссертации сформулировано 16 выводов, полностью соответствующих содержанию работы. Из мелких огрехов отметим слово «медодики» как в тексте, так и в содержании. Некое исследование следовало бы назвать пионерным, а не пионерским (что указывало бы несколько иное отношение) (с. 157). Спорным является русское название «люцерна слабоусеченная» для Мейсар п.илса~иlа (с. 170), в то время как более или менее общепринятым является «люцерна усеченная».

Имеются отдельные неоправданные англицизмы («Бьшо изолировано 3 независимо полученных мутанта...», с. 235, "предоминантный транскрипт", с. 107, 147). Встречается не объясненное понятие "Условный процент", с. 241 и далее. На Рисунках 36, 37 не указано, что за окрашивание применялось. То же относится к Рисункам 43-46, 62, 111, 113. На Рисунке 37 имеется не объясненное обозначение МК. Представляется не вполне уместным выражение типа "Расщепление в Г!" (Таблица 40), поскольку Г!, в полном соответствии с законами Менделя, демонстрирует единообразие, что и отражают данные Таблицы.

Вызывает сомнение корректность употребления термина «клонирование» гена как синонима расшифровки его первичной структуры. Колонтитул «заключение» начинается с 421 страницы, тогда как само заключение начинается с 431 с. В выводе 3 говорится о двух генетических подпрограммах, но не упомянута программа, частями которой она является. Достаточно объемный (42 с.) автореферат полностью соответствует содержанию диссертации. Из автореферата узнаем, что по теме диссертации опубликовано ни много ни мало 40 печатных работ в журналах, рекомендованным ВАК и приравненным к ним, в том числе в таких как Гипс!!опа! Р1ап! В!о1ояу, !опгпа! оГ Р1ап1 РЬуз!о1ояу, Хе~ч Р!ту1о1оря1, Рго1ор!аяпа, БуптЬ!оз!з, Аппа1з оГ Во1апу, В1о1оуа, ЕпрЬу!!са, Р1ап! Яс1епсе, ТЬеоге!!са1 апс! Арр1!ес! Оепе!!сз.

Следует заключить, что диссертационная работа Цыганова Виктора Евгеньевича "Молекулярно-генетические и клеточные механизмы дифференцировки симбиотического клубенька», представленная на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальностям .