Отзыв официального оппонента 3 (Молекулярно–генетические и клеточные механизмы дифференцировки симбиотического клубенька)

ОТЗЫВ официального оппонентаГоголева Юрия Викторовича на диссертациюЦыганова Виктора Евгеньевича«МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫДИФФЕРЕНЦИРОВКИ СИМБИОТИЧЕСКОГО КЛУБЕНЬКА»,представленную на соискание ученой степенидоктора биологических наук по специальностям03.01.05 – физиология и биохимия растений и03.02.07 – генетикаАктуальность. Бобово-ризобиальный симбиоз является одним из важнейших дляфундаментальнойбиологиипримеромрастительно-микробныхвзаимодействий.Исследования в данном направлении вызывают большой интерес в мировом научномсообществе, что подтверждается многочисленными публикациями в престижных научныхжурналах, а также проведением специализированных международных научных форумов.Детальное понимание молекулярно-генетических и клеточных механизмов, лежащих воснове развития азотфиксирующего клубенька, является важным и для практикисельскохозяйственного производства.

Активное использование высокоэффективныхрастительно-микробных систем, в том числе созданных с использованием бобоворизобиального симбиоза, открывает широкие возможности для развития «устойчивого»экологически ориентированного земледелия, бурно развивающегося в последнеедесятилетие. Поэтому не вызывает сомнений высокая актуальность представленнойдиссертации.Содержание работы. Работа представлена на 509 страницах, содержит 114 рисунков и 42таблицы, список литературы содержит 741 библиографическую ссылку на источники, изкоторых 20 представляют отечественные публикации. Впечатляющий объем диссертацииотражает результаты исследований в течение двадцати лет. Рукопись В.Е. Цыгановапостроена по традиционному плану и содержит следующие разделы: «Списоксокращений», «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методики», «Результаты иобсуждение», «Заключение» и «Выводы».Во Введении автор убедительно обосновывает актуальность исследований, строгоформулирует цель работы и ставит необходимые для ее выполнения задачи.Глава 1 «Обзор литературы» представляет собой исчерпывающую сводку научныхисточников, в которой дается детальное описание различных аспектов развития клубенькаот самых ранних этапов сигнального диалога между бобовыми растениями и ризобиями,до финальной стадии старения.

Большим достоинством обзора является удачная попыткаавтора провести синтез как генетического, так и физиологического и структурноцитологического подходов к описанию представляемого материала. Кроме того, в обзорепроанализированы как ранние работы по данной проблеме, так и самые последние статьи.Помимо описания собственно развития клубенька, приведены сведения о влиянии на этотпроцесс стрессовых факторов, таких как плотные почвы и присутствие кадмия.В главе 2 «Материалы и методики» представлен богатый арсенал используемых в работеметодов.

Приведено детальное описание процедур пробоподготовки клубеньков и процессих исследования различными способами световой, конфокальной и электронноймикроскопии. Продемонстрирован так же широкий набор как классических методовгенетического анализа, так и самых современных молекулярно-генетических методов.Даноподробноеописаниемногихпротоколов,позволяющеевоспроизвестипредставленные эксперименты.Глава 3 «Результаты и обсуждение» содержит 15 разделов:1. Выделение симбиотических мутантов;2.

Генетический анализ (гибридологический анализ, комплементационный анализ,локализация симбиотических генов на генетической карте гороха;3. Выявление основных симбиотических локусов гороха, контролирующих ранниестадии реализации генетической программы симбиогенеза;4. Идентификация гена гороха, ортологичного гену лядвенца LjNIN, являющегосяпервым клонированным геном бобовых растений и ключевым регуляторомсимбиогенеза на ранних стадиях;5. Анализ роли арабиногалактанпротеин–экстензинов в реализации генетическойподпрограммы инфекции тканей клубенька ризобиями у гороха;6. Анализ роли пероксида водорода в реализации генетической подпрограммыинфекции тканей клубенька ризобиями у гороха;7.

Анализ роли реорганизации тубулинового цитоскелета в дифференцировке клетоксимбиотических клубеньков гороха и M. truncatula при реализации поздних этаповгенетической программы симбиогенеза;8. Анализ роль этилена в реализации ранних и поздних этапов генетическойпрограммы симбиогенеза у гороха;9. Анализ роли нитратов в реализации генетической программы симбиогенеза угороха и L. japonicus;10. Изучение изменений в характере экспрессии генов Rhizobium leguminosarum bv.viciae при реализации генетической подпрограммы инфекции тканей клубенькаризобиями у гороха;11. Изучение проявления защитных реакций со стороны растения при реализациипоздних этапов генетической программы симбиогенеза;12.

Изучениефинальнойстадиидифференцировкиклубеньков—старения,завершающей реализацию генетической программы симбиогенеза;13. Получение генетической модели для исследования влияния кадмия на развитиесимбиотических клубеньков у гороха;14. Получение трансгенных штаммов R. leguminosarum и изучение возможностисоздания и использования растительно–микробной системы для фиторемедиациипочв, загрязненных кадмием;15. Получение генетической модели для исследования влияния плотных почв наразвитие корневой системы и симбиотических клубеньков у гороха.По всем направлениям исследований были достигнуты значимые результаты.Особо следует отметить получение новых мутантов гороха по симбиотическимпризнакам. Это значительно расширило имеющуюся у автора генетическую коллекцию,котораяиспользоваласьприпроведенииданногоисследования.Проведенныйгенетический анализ многих мутантов позволил выявить новые аллели симбиотическихгенов, картировать ряд симбиотических локусов на генетической карте гороха.

Большимдостижением явилось выявление гена гороха, ортологичного гену лядвенца японскогоLjNIN, являющегося ключевым регулятором симбиогенеза на ранних стадиях. Благодаряэтому продемонстрировало возможное использование ряда модельных бобовых.Концептуальная новизна работы заключается в том, что автором сформулировано иобосновано положение о существовании двух генетических подпрограмм симбиогенеза:1) инфекции тканей клубенька ризобиями и 2) органогенеза клубенька; обладаяотносительной независимостью этиподпрограммы содержат точки их взаимногоконтроля. Дано не только детальное описание этих подпрограмм, но и проведеноразграничение их «полномочий», а так же условий реализации.Интересными представляются результаты по выявлению роли различных факторов,таких как повышенные концентрации пероксида водорода, этилена, нитратов в развитииклубенька.

Для этого были использованы мутанты, у которых развитие симбиозаблокируется на различных стадиях.Особого внимания заслуживает элегантное ультрацитоструктурное исследованиеорганизации тубулинового цитоскелета в клубеньках гороха и модельного бобовоголюцерны слабоусеченной, которое явилось важным шагом на пути развития новогонаправления – сравнительной клеточной биологии бобово-ризобиального симбиоза. Вэтой части исследования наиболее полно проявилось виртуозное и творческое владениеавтором цитологическими методами. Благодаря этому впервые было показано, что выходбактерийявляетсянеобходимымусловиемдляреорганизациикортикальныхмикротрубочек, что сопровождает дальнейший рост инфицированных клеток.

Сделанноенаблюдение,чтоопределеннаяорганизацияэндоплазматическихмикротрубочексопровождает определенный видоспецифичный порядок расположения симбиосом винфицированной клетке дает новое представление о роли цитоскелета в бобоворизобиальном сибиогенезе и расширяет наш взгляд на глубину эволюционныхпреобразований макроорганизма на пути становления этой формы растительномикробного взаимодействия.

По результатам данного раздела построена обобщающаясхема организации кортикальных и эндоплазматических микротрубочек в различныхгистологических зонах корня и клубенька у гороха и люцерны слабоусеченной.Исследования нарушений симбиоза и снижения его эффективности позволиливыявить строгий контроль за развитием инфекции со стороны растения и способностьорганизма-хозяина воспринимать ризобии в качестве патогенов.

Было показано, чтостарение симбиотического клубенька, по-видимому, является универсальной реакциейбобового растения на формирование неэффективных клубеньков.Весьма перспективными представляются исследования, посвященные получениюгенетических моделей для изучения стрессовых факторов, влияющих на симбиоз: мутантас повышенной устойчивостью к кадмию и мутанта, характеризующегося повышеннойчувствительностью к плотности субстрата. Имеются основания полагать, что полученнаярастительно–микробнаясистемаможетнайтипрактическоеприменениедляфиторемедиации почв загрязненных кадмием.Полученныерезультатыпрошливсестороннююапробацию,полностьюпредставлены научной общественности в печати. Материалы диссертации получилиобсуждение на 60-ти международных и отечественных научных конференциях, изложеныв 40 публикациях в отечественных и международных журналах, рекомендованных ВАК,включая ведущие в данной области высокорейтинговые издания, такие как PlantPhysiology, New Phytologist, Molecular-Plant Microbe Interactions, Annals of Botany.Опубликованные статьи и представленный автореферат соответствуют содержаниюдиссертации и отражают основные результаты работы.При чтении рукописи у оппонента возникли некоторые вопросы и замечания.Прежде всего, следует отметить, что традиционные ссылки на опечатки в данном случае.