Отзыв официального оппонента 2 (Молекулярно–генетические и клеточные механизмы дифференцировки симбиотического клубенька), страница 2

Мутанты, индуцированные на линии БОЕ, были отнесены к ранее описанным группам комплементации и показана принадлежность мутанта КЬЕ1хЪ", индуцированного на сорте Гша1е, к новой группе комплементации Рыут42, что, вероятно, приближает исследователей к получению в значительной мере исчерпывающего набора симбиотических генов гороха, определяемых методами экспериментального мутагенеза. Анализ результатов блокирования процессов симбиоза на его ранних стадиях у ряда мутантов гороха дал автору основания предположить возможное наличие двух генетических подпрограмм развития симбиотического клубенька, предусматривающих стадии инфицирования растительной ткани и его органогенеза, с проявлениями взаимного контроля реализации данных подпрограмм.

В ходе исследований геномной синтении между горохом и лядвенцом был клонирован ген Рхзу~и35, работа с которым дала весомый вклад в развитие общей методологии выявления симбиотических генов культур, важных для сельского хозяйства. Анализ распределения арабиногалактанпротсин-экстензинов в клубеньках гороха продемонстрировал, что для нормального функционирования инфекционной нити важен механизм„обеспечивающий их направленную секрецию в просвет инфекционной нити.

Установлено, что пероксид водорода, принимающий участие в защитных реакциях растения, необходим также и при созревании инфекционных нитей в ходе дифференциации клубенька. Установленная трехмерная ор~анизация тубулинового цитоскелета и симбиотических структур в различных типах клеток клубеньков люцерны н гороха свидетельствует о решающей роли эндоплазматических микротрубочек в процессах роста и функционирования инфекционных нитей и капель. Показано, что по мере дифференциации неинфицированных и колонизированных бактериями растительных клеток кортикальные микротрубочки образуют структуру (паттерн)„характерную для клеток корня из переходной зоны с поперечным расположением пучков микротрубочек относительно продольной оси клетки.

Однако при выходе бактерий из инфекционных капель данная структура становилась неупорядоченной, что по мнению автора диссертации, возможно, необходимо для последующего увеличения размеров инфицированной клетки при дифференциации. Отмечены различия паттернов эндоплазматических микротрубочек вокруг симбиосом в клубеньках гороха и люцерны„отражающие разницу в структуре симбиосом для данных видов растений. При выявлении нового чувствительного к этилену мутанта по гену Рязут12 получены свидетельства того, что развитие клубеньков как при росте инфекционной нити в коре корня, так и при формировании клубеньковой меристемы контролируется этиленом. Кроме того, было показано, что этилен, возможно, контролирует также функционирование меристсмы в зрелом клубеньке.

Анализ связанных и не связанных с симбиозом бактериальных генов продемонстрировал, что их экспрессия постепенно ослабевала в ходе дифференциации бактероидов, за исключением симбиотических генов, регулируемых кислородом. Установлено, что при нарушениях, сказывающихся на эффективности процессов образования симбиоза, полезные бактерии могут воспринимаются растением как патогены, поскольку единичные мутации в генах гороха, контролирующих поздние стадии развития симбиоза, приводили к индукции специфических защитных реакций.

Обнару>кено, что в клубеньках мутантов, у которых развитие клубеньков было блокировано на различных стадиях, активировались гены, ассоциированные со старением. На этом основании автор допускает, что общей реакцией в ответ на неэффективное развитие клубенька является также раннее старение клеток. Наконец, эксперименты с выявленными в ходе диссертационной работы мутантами ЯОЕСо1 и ЯОЕсг1 позволили разработать адекватные генетические модели и на примере токсичных концентраций кадмия и плотных почв проанализировать устойчивость расти- тельно-микробной системы к действию данных стрессовых факторов. Сделанные автором выводы ясны и информативны, а автореферат диссертации вполне адекватен ее содержанию.

Обоснованность научных положений, выводов и рекомендаций, сформулированнгях в диссертации, обеспечена надежностью и глубокой проработкой диссертантом основополагающих теоретических представлений о бобоворизобиальном симбиозе, их убедительным развитием по итогам исследований, представленных в диссертационной работе В.Е Цыганова. Достоверность полученных экспериментальных данных гарантируется разнообразием использованных высокоэффективных методов исследования, их адекватностью поставленным в диссертации задачам, убедительной статистической обработкой результатов.

Описанию научной новизны результатов рассматриваемой диссертационной работы, изложенных выше„посвящены две страницы ее текста (стр. 24-26), на которых практически каждое предложения начинается со слова «впервые», всего 21 позиция. В несколько редуцированном варианте такое описание в автореферате составлено из 15 позиций. Оппонент заявляет о своем согласии с констатацией новизны, приведенной на стр. 24-26 диссертации и стр.

5-6 ее автореферата, и кратко отмечает, что эта новизна обеспечена, в частности: расширением коллекции симбиотических мутантов гороха; клонированием нового симбиотического гена; обнаружением двух взаимно контролируемых генетических подпрограмм развития симбиоза; характеристиками трехмерной организации тубулинового цитоскелета клубеньков гороха и люцерны; оценками роли этилена в развитии и функционировании клубеньковой меристемы; выявлением условий экспрессии связанных с симбиозом генов ризобий; демонстрацией зависимости реакции растительного партнера на взаимодействие с бактериями и его физиологического состояния от нарушений эффективности симбиоза; получением растительного мутанта с повышенной устойчивостью к кадмию; получением трансгенных штаммов ризобий„несущих гены гороха, кодирующие металлотионеины, с оценками перспектив использования их симбиоза с устойчивым к кадмию мутантом гороха для фиторемедиации почв, загрязненных тяжелыми металлами.

Очевидна также и практическая значимость существенного пополнения коллекции симбиотических мутантов гороха, развития методологии клонирования симбиотических генов у важных для сельского хозяйства бобовых растений на основе полученных результатов в области генетики модельных бобовых культур, использованных в диссертационной работе. Полученные сведения о молекулярно-генетических механизмах стабилизации процессов симбиоза могут быть применены для направленного создания практически значимых систем с высокоэффективными растительно-микробными взаимодействиями. Трансгенные штаммы ризобий, депонированные в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ОСХН РАН, представляют несомненный интерес для развития технологий фиторемедиации почв, загрязненных кадмием.

По итогам изучения диссертационной работы и относящихся к ней материалов у оппонента не возникло серьезных замечаний по ее существу. Однако появилось желание подискутировать с диссертантом по поводу отдельных терминов и понятий. 1. Со времен К.С. Мережковского (1905 г.) и затем Л. Маргулис (1960-е годы) термин «симбиогенез» (стр. 20, 22-24 и далее по тексту диссертации) прочно укрепился для обозначения эндосимбиотического происхождения клеточных органелл эукариот от первоначально ассоциированных ими клеток прокариот (бактерий и архей), точнее в результате первоначального слияния клеток прокариот.

В англоязычной литературе— «зушЬ)ояепез(з», словарный перевод которого также отражает указанную выше этимологию (чжм.ши!111гап.пь'с/т,ехе?С(.=1йз=зушЬ(отпев)зй11=1). Так что его заимствование для обозначения развития бобово-ризобиального симбиоза хотя и соблазнительно, но едва ли целесообразно. Приходиться, видимо, признать более приемлемым в данном случае выражение «развитие симбиоза», что и делает автор, например, на стр, 63 и др.

2. В давней дискуссии по поводу термина «дифференцировка» оппонент является сторонником более благозвучного (на субъективный взгляд оппонента) термина «дифференциация», фонетически лучше, как кажется, соответствующего исходному латинскому «й(Тегепйа». 3. «Осцилляции ионов кальция» (стр. 38 и далее по тексту диссертации) не вполне удачный термин, поскольку слово «осцилляции» буквально означает «колебания».

Заметим, что в физике термин «осцилляция» применяется также для обозначения превращения одних элементарных частиц в другие. Так что правильнее было бы говорить об «осцилляции концентрации ионов кальция», что, собственно, и отражено в надписи на рисунке 3, стр, 39 диссертации. Поскольку это выражение в тексте диссертации встречается довольно часто, можно было бы использовать данный условный термин хотя-бы после соответствующего пояснения при его первом употреблении в тексте. 4. Вопреки утверждению на стр.

72 диссертации, гелеобразное состояние биополимерной системы не является «твердым», а отличается лишь потерей текучести с сохранением эластичности геля и возможности передвижения в нем (диффузия, электрофорез и т.п.) частиц (молекул, клеток) определенного размера, выше которого подобное переме- щение становится невозможным. Данные замечания имеют лишь уточняющий, технический, но не принципиальный Заведующий лабораторией иммунохимии Федерального государственного бюджетного учреждения Института биохимии и физиологии растений и микроорг Российской академии наук (ИБФРМ РАН) доктор химических наук, профессор 1'Я Щеголев 410049, Саратов, просп, Энтузиастов, дом.