Отзыв официального оппонента 2 (Молекулярно–генетические и клеточные механизмы дифференцировки симбиотического клубенька)

Отзыв официального оппонента Щеголева Сергея К)рьевича на диссертацию Цыганова Виктора Евгеньевича на тему: «Молекулярно-генетические и клеточные механизмы дифференцировки симбиотического клубенька», представленную на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальностям 03.01.05 — физиология и биохимия растений и 03.02.07 — генетика Результаты фундаментальных таксономических исследований земной биоты, отраженные в публикациях последних лет в ведущих мировых изданиях по сравнительной геномике, биоинформатике и т.п., демонстрируют подавляющий вклад прокариот в земное биоразнообразие.

Указанные наблюдения касаются как культивируемых в лабораторных условиях, так и некультивируемых объектов, источником информации о жизнедеятельности которых становятся метагеномные данные. В дополнение к известным описаниям феномена сосуществования эу- и прокариот в разнообразных симбиотических системах с перераспределением между партнерами тех или иных наборов клеточных метаболизмов, результаты обширных метагеномных исследований свидетельствуют о принадлежности к таким системам также и большого числа некультивируемых объектов. Это еще раз подчеркивает огромное принципиальное значение симбиозов в эволюции и существовании жизни, а также актуальность и важность их фундаментальных и прикладных исследований.

Бобово-ризобиальный симбиоз, являющийся предметом изучения в диссертационной работе В.Е. Цыганова, привлекает внимание исследователей уже более 100 лет и имеет все основания считаться одним из классических примеров растительно-микробных симбиотических взаимодействий. Выяснение их молекулярно-генетических и клеточных механизмов несомненно важно не только как источника новых знаний в области физиологии и биохимии растений и микроорганизмов, но и как основы для развития разнообразных биотехнологий, обеспечивающих повышение плодородия почв и решение актуальных задач растениеводства с экологически чистыми и оздоровляющими продуктами, защиту растений от патогенов и среды обитания человека от ксенобиотиков, получение биологически активных веществ широкого спектра действия и т.д.

Данный тип симбиоза отличается высокой степенью интегрированности партнеров, что связано, в том числе, с возникновением и закреплением в ходе эволюции специальных органов бобовых растений — клубеньков, мест скопления и функционирования почвенных азотфиксирующих бактерий рода ризобий, обеспечивающих растения азотным и минеральным питанием, другими важными физиологически активными веществами в обмен на аналогичную поддержку со стороны растительного партнера. Однако целый ряд принципиальных вопросов, относящихся к его молекулярным и клеточным механизмам, остается до сих пор недостаточно исследованным.

Это справедливо, в частности, для процессов дифференциации клеток симбиотического клубенька, создающих условия для аккумулирования в них симбиосом — специализированных ком- партментов, заключающих в себе бактероиды, в которые ризобии дифференцируются для осуществления своих симбиотических функций. Весьма существенным аспектом подобных исследований является оценка роли разнообразных стрессовых факторов, обусловленных постоянным увеличением антропогенной нагрузки на сельскохозяйственные растения, связанной с наличием в почве тяжелых металлов, ее радиоактивным заражением, засухой, засолением и уплотненные почвы в результате использования тяжелой сельскохозяйственной техники и т,п, Все перечисленное выше дает основания констатировать несомненную актуальность темы диссертации В.Е Цыганова, главной целью которой было «выявление молекулярно-генетических и клеточных механизмов дифференцировки симбиотического клубенька в норме и под воздействием абиотических стрессорных факгоров».

Для ее достижения автором решались следующие конкретные задачи: 1. Расширить коллекцию симбиотических мутантов гороха — получить новые генетические модели — для изучения симбиогенеза. Для этого получить с помощью экспериментального мутагенеза лабораторной линии гороха 86Е новые симбиотические мутанты с нарушениями развития клубеньков и провести их генетический анализ. 2.

Выявить основные симбиотические локусы гороха„контролирующие ранние стадии реализации генетической программы симбиогенеза. 3. Разработать принципы перехода от модельных систем к хозяйственно значимым на примере идентификации гена гороха, ортологичного гену лядвенца 1.1Х!Х, являющегося первым клонированным геном бобовых растений и ключевым регулятором симбиогенеза на ранних стадиях.

4. Изучить роль арабиногалактанпротеин-экстензинов и пероксида водорода в реализации генетической подпрограммы инфекции тканей клубенька ризобиями у гороха. 5, Изучить роль реорганизации тубулинового цитоскелета в дифференцировке клеток симбиотических клубеньков гороха и М г~чисагв1а при реализации поздних этапов генетической программы снмбиогенеза. б. Изучить роль этилена в реализации ранних и поздних этапов генетической программы симбиогенеза у гороха. 7. Изучить роль нитратов в реализации генетической программы симбиогенеза у гороха и ь. 1ирол1сик.

8. Изучить изменения в характере экспрессии генов ЯЬ|войит 1едитт<иигит Ы. Ис1ие при реализации генетической подпрограммы инфекции тканей клубенька ризобия- ми у гороха. 9. Изучить проявления защитных реакций со стороны растения при реализации поздних этапов генетической программы симбиогенеза. 10. Изучить финальную стадию дифференцировки клубеньков — старение, завершающую реализацию генетической программы симбиогенеза. 11.

Получить генетическую модель и исследовать влияние кадмия на развитие корневой системы и симбиотических клубеньков у гороха. Изучить возможности создания и использования растительно-микробной системы для фиторемедиации почв, загрязненных кадмием. 12. Получить генетическую модель и исследовать влияние плотных почв на развитие корневой системы и симбиотических клубеньков у гороха. Одним из главных инструментов в решении перечисленных выше задач было использование и расширение имеющейся коллекции мутантов растений по симбиотическим признакам, обеспечивающих применение в исследованиях адекватных генетических моделей. Диссертация В.Е Цыганова написана по не вполне привычной для оппонента схеме, однако полностью соответствующей требованиям пункта 5З.2, «ГОСТ Р 7.0.11-2011. Система стандартов по информации, библиотечному и издательскому делу.

Диссертация и автореферат диссертации. Структура и правила оформления». Рукопись диссертации структурирована по разделам, подразделам, пунктам и подпунктам, включает введение, три основных раздела, заключение, выводы, благодарности и список литературы, снабжена оглавлением и списком сокращений. Первый раздел представляет собой обзор литературы. Во втором разделе (названном Главой 2), дано описание материалов и методик.

Полученные автором оригинальные результаты и их обсуждение представлены в разделе 3 (названном Главой 3), в котором материалы, отражающие решение поставленных автором 12 задач, распределены по 15 подразделам. Работа хорошо оформлена и включает весьма наглядный и качественный иллюстративный материал.

Диссертация изложена на 509 страницах, содержит 114 иллюстраций, 42 таблицы и 741 литературный источник, хорошо н ясно написана„прекрасно иллюстрирована. В авто- реферате приведены сведения об опубликованных автором с коллегами 40 печатных работах, 40 из которых — рецензируемые статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Во введении к диссертации дана краткая характеристика положения в отраслях знаний по теме диссертации, отмечаются нерешенные вопросы, формулируется цель и задачи исследования, указана научная новизна работы, ее теоретическое и практическое значение, приведены защищаемые положения, отмечены степень достоверности и апробация результатов, В разделе 1 (литературный обзор) приводятся и анализируются известные данные по генетическому контролю клеточных механизмов развития и функционирования симбиотического клубенька.

Здесь автором предпринята вполне удачная по мнению оппонента попытка связать развитые в литературе представления о клеточных механизмах симбиоза со сведениями по генетическому контролю взаимодействия растений и бактерий в контексте темы и цели диссертации. В разделе 2 дано описание использованных материалов и методик, Растительные объекты включали 3 вида бобовых растений: посевной горох 1РЫипг ки~1гит Ь.) и два модельных вида, отличающиеся относительно небольшим размером генома, разработанными протоколами их эффективной генетической трансформации, достаточно большой коллекцией мутантов — лядвенец японский (Хогик~ароп1сак (Кеде1) К. Ьагзеп) и люцерна слабо- усеченная (Мейсара ггипсшк1а Оаег1п.).

Со стороны клубеньковых бактериальных парт- нерон использованы штаммы видов Яп1яойит 1«диттозагит и ИпоМ|гоЬ|ит теИобь Приведены условия выращивания растений, методики мутагенеза и отбора мутантов, методы гибридологического анализа и совместного наследования. Описаны методики пробоподготовки и иммунодетектирования объектов для световой, лазерной сканирующей конфокальной и электронной микроскопии, гистохимических и цитохимических исследований, анализа развития инфекции и формирования клубеньков, экспрессии бактериальных генов. Представлены способы выделения растительной ДНК и геномной ДНК бакте- рий, их плазмидной ДНК, эндонуклеазной рестрикции ДНК н ее лигирования, методы ПЦР в реальном времени и количественного анализа экспрессии транскрипционных репортерных генов, методы анализа экзогенных гормонов и определения их содержания, определения кадмия с применением масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой.

В 15 подразделах раздела 3 диссертации В.Е Цыганова представлено описание и обсуждение полученных результатов решения указанных выше 12 задач исследования. Кратко основная суть приведенного в этом разделе весьма обширного и многогранного экспериментального материала состоит в следующем. Была существенно расширена коллекция мутантов гороха по симбиотическим признакам, что позволило получить новые генетические модели и исследовать ряд особенностей дифференциации симбиотического клубенька.