Отзыв ведущей организации (Молекулярно–генетические и клеточные механизмы дифференцировки симбиотического клубенька)

утиерь~аю ':.:::" ,4.'-;.:;;: ' '. -', -', '.И.о. зам. директора ВИР по науке д.б.н., Е.К. Потокина ОТЗЫВ ведущего учреждения на диссертационную работу Цыганова Виктора Евгеньевича «МОЛЕКУЛЯРНΠ— ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ СИМБИОТИЧЕСКОГО КЛУБЕНЬКА»„представленную на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальностям 03.01.05 Физиология и биохимия растений и 03.02.07 Генетика Симбиозы растений с полезной почвенной микрофлорой, включающей азотфиксирующих прокариот, - важнейшие факторы адаптации.

Известно, что создающиеся в результате симбиоза надорганизменные генетические системы приобретают принципиально новые признаки, отсутствующие у партнеров вне взаимодействия. Эти новые признаки значительно расширяют их экологические возможности. Диссертация В.Е.Цыганова посвящена клеточным механизмам дифференцировки симбиотического клубенька у гороха, как результата координированной экспрессии генов обоих симбионтов. Выяснение структурно-функциональных основ симбиотического взаимодействия, а именно формирования азотфиксирующего клубенька, его генетической детерминированности является актупльным для развития теоретических основ симбиоза, понимания процессов дифференциации тканей, фопмообразования„в целом биологии развития.

Кроме того, это актуально и для прикладного использования симбиотических взаимоотношений; научно-обоснованной селекции принципиально новых сортов с повышенной эффективностью азотфиксации. Учитывая сложность функционирования надорганизменной системы, где совместно, сопряженно и слаженно должны действовать, как минимум, два партнера, необходим комплексный, интегрированный подход к ее изучению. Поэтому механизмы таких взаимодействий изучают команды генетиков, молекулярных биологов, микробиологов, цитологов, физиологов и т.п.

То есть перед диссертантом стояла проблема некой методической универсальности, с чем он справился блестяще, Многие аспекты и этапы взаимодействия ризобий и гороха изучены как сотрудниками ВНИИСХМ, откуда вышла данная работа, так и другими учеными, включая международные коллективы. Данная работа интересна тем, что она детализирует и выявляет генетические и молекулярные детерминанты, биохимические компоненты, а также структурно-клеточные основы процесса взаимодействия симбионтов поступательно, последовательно, начиная с момента узнавания партнеров друг другом, заканчивая старением и умиранием клубенька. Диссертация изложена на 509 страницах. Основные компоненты ее структуры: введение, 3 главы, заключение, выводы и список литературы. Последний содержит 741 литературных источников.

Первая и вторая главы— традиционно — «Обзор литературы» и «Материал и методики». В третьей главе изложено все исследование. Это вынудило автора к излишнему дроблению текста, его дискретности и усложнению нумерации разделов. Гораздо логичнее и практичнее было бы подразделить экспериментальную часть на несколько глав. Приводим краткий обзор работы. В первой главе «Генетический контроль клеточных механизмов развития и функционирования симбиотич еского клубе нька» изложены современные представления о событиях, изучению которых посвящена данная работа. Обстоятельно (как и все в данной работе) изложены все стадии развития и функционирования клубенька, начиная с сигналинга, начального взаимодействием ризобий и растения, заканчивая старением клубенька.

Подробно изложены факторы, запускающие программу инфекции и развития клубенька. Дальнейшие события, а именно рост инфекционной нити, формирование клубенькового примордия в клетках коры корня, выход бактерий в цитоплазму клеток растения, формирование меристем у недетерминированных клубеньков и т.д. описаны как с позиций их молекулярно-генетической детерминации, так и структурно-клеточных механизмов.

Большое внимание уделено обзору работ о тубулиновом цитоскелете в клетках клубеньков, поскольку как известно, и как показано самим диссертантом, реорганизация цитоскелета является одним из основных механизмов дифференцировки клеток симбиотического клубенька. Автор считает, что органогенез клубенька зависит от степени развития процесса инфекции и вовлекает в обзор множество известных фактов, подтверждающих это. Следует отметить, что в обзоре в качестве схематического изображения описываемых процессов приведены иллюстрации из цитируемых работ, в подписях к которым детально и доступно обобщаются основные этапы органогенеза и функционирования клубенька.

Далее освещены современные представления о влиянии на формирование клубенька фитогормонов (ауксинов„цитокининов, гиббереллинов, абсцизовой кислоты, этилена и брассиностероидов) и таких важных сигнальных молекул, как жасмоновая кислота, стриголактоны и оксид азота. Заканчивают обзор немногочисленные пока литературные данные о влиянии на формирование клубеньков таких эдафических стрессоров как загрязнение почвы кадмием и ее уплотнение.

В целом литературный обзор свидетельствует о широкой эрудиции автора, интегрированного знания им различных аспектов изучаемой проблемы. Глава 2 знакомит с материалом и методами исследования. Наряду с горохом растительный материал включал модельные виды бобовых: лядвенец японский (Лоцию ~аротсиз (Кеде1) К. Ьагзеп) и люцерну слабоусеченную (Мейсадо п.ипса~и!и баете.). Были использованы различные штаммы ризобий: КЬггоЬшт 1едиттокагит Ьч. Ис1ае. Поскольку в задачи данного исследования входило выяснение влияния эдафических стрессоров на развитие корневой системы и симбиотических клубеньков у гороха материалом явились также полученные в ходе выполнения данной работы мутанты гороха: КбЕсг1, характеризующийся повышенной чувствительностью к плотности субстрата (Тзупапоч е1 а1„2000), и ЯОЕСФ, характеризующийся повышенной устойчивостью к кадмию и повышенной его аккумуляцией (Тлуяапоч е1 а1., 2007), В работе использован комплекс методов генетики, физиологии, молекулярной биологии.

Для идентификации генов бобовых, вовлеченных в развитие и функционирование симбиоза, использовали экспериментальный мутагенез, исследование дифференциальной экспрессии генов, гибридологический анализ. Применен современный набор методов молекулярной генетики: выделение ДНК растений и бактерий, выделение плазмидной ДНК, рестрикция ДНК с помощью эндонуклеаз, лигирование ДНК; ПЦР с детекцией в реальном времени и т.д., а также физиологические методы анализа влияния экзогенных гормонов и определения содержания гормонов. Использовали достаточно большой арсенал методов микроскопии: световой, лазерной сканирующей конфокальной и электронной, с применением гистохимических и цитохимических методик.

В третьей, основной главе диссертации подробно и последовательно излагается исследование двух генетических подпрограмм развития симбиотического клубенька: 1) инфекции тканей клубенька ризобиями («судьбы» бактериальной клетки) и 2) орган о ген еза клубень ка. Существование этих подпрограмм обоснованно с участием автора диссертации и им выявлено наличие точек взаимного контроля реализации данных подпрограмм: 3 точек для инфекции тканей клубенька ризобиями и одной для органогенеза клубенька.

Анализ этой большой главы нам проще привести тезисно, положив в основу тезисов элементы новизны исследования, которых в работе множество. На современном этапе известно около 40 генов гороха, участвующих в становлении симбиотических отношений с ризобиями. Автор диссертации расширил коллекцию симбиотических мутантов гороха, выявил новые серии аллельных мутантов для ряда групп комплементации симбиотических генов гороха и описал новый локус — Рззут42. Впервые ряд симбиотических локусов картирован на генетической карте гороха. На основе фенотипической характеристики большого набора Модмутантов гороха классифицированы симбиотические гены гороха в соответствии со стадией развития клубенька, которую они контролируют.

Впервые на основе анализа микросинтении генома гороха с геномом Ео~ил 1арошст и с использованием детальной характеристики фенотипических проявлений мутаций клонирован симбиотический ген гороха Рззут3э, что является абсолютно новаторским не для модельных бобовых объектов. Наличие цитоскелета - непременное условие приобретения и поддержания дифференцированной клеткой требуемой формы. Поэтому большое место в работе заняло изучение роли реорганизации тубулинового цитоскелета в дифференцировке клеток симбиотических клубеньков гороха и М 1гипса~и1а при реализации поздних этапов генетической программы симбиотического партнерства.

Впервые продемонстрирована трехмерная организация тубулинового цитоскелета клубеньков, которая сопоставлена с организацией симбиотических структур в каждой гистологической зоне клубенька. Характер организации микротрубочек в клетках инфицированных и неинфицированных тканей позволил лишний раз утвердиться в том, что дифференцировка клеток клубенька тесно связана с дифференцировкой бактерий и/или их функционированием, Выявлено, что микротрубочки в инфицированных клетках Мейсар гптса1и1а и гороха, а также судя по литературным данным о них в литературе для других бобовых - сои и люпина имеют различный паттерн.

Этот факт в числе ряда других межвидовых различий процесса автор диссертации причисляет к доводам, собираемым в копилку инициируемого им нового научного направления - сравнительной клеточной биологии бобовых растений. Следует отметить высокое качество фотографий со срезов с иммунолокализацией тубулинов, иллюстрирующих этот раздел работы. Показана детерминированность направленной секреции арабиногалактанпротеин — экстензинов - основного компонента матрикса инфекционных нитей и капель - при их нормальном и аномальном развитии. Доказано также участие пероксида водорода в росте и созревании инфекционных структур. Убедительно показано, что этилен контролирует развитие клубеньков на различных стадиях: при росте инфекционной нити в коре корня, а также при формировании клубеньковой меристемы, и вероятно, контролирует ее функционирование в зрелом клубеньке.