Автореферат (Спектрально-кинетические исследования фотофизических процессов с участием молекул красителей и биомолекул в присутствии наночастиц серебра)

На правах рукописиЗЮБИН Андрей ЮрьевичСПЕКТРАЛЬНО-КИНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯФОТОФИЗИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ С УЧАСТИЕМ МОЛЕКУЛКРАСИТЕЛЕЙ И БИОМОЛЕКУЛ В ПРИСУТСТВИИНАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА01.04.05 — ОптикаАвторефератдиссертации на соискание ученой степеникандидата физико-математических наукКалининград2018Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательномучреждении высшего образования «Балтийский федеральный университет имениИммануила Канта»Научный руководитель:кандидат физико-математических наук, доцент,ФГАОУ ВО «Балтийский федеральный университетимени Иммануила Канта»Самусев Илья ГеннадьевичОфициальные оппоненты:доктор физико-математических наук, профессор кафедра молекулярной биофизики и физики полимеровфизический факультета ФГАОУ ВО «СанктПетербургский государственный университет»Касьяненко Нина Анатольевнадоктор химических наук, профессор кафедры физикифизико-технического института ФГБОУ ВО «Саратовский государственный технический университет имениГагарина Ю.А.»Мельников Геннадий ВасильевичВедущая организация:ФГАОУ ВО «Оренбургский государственный университет»Защита диссертации состоится «28» июня 2018 г.

вчасов на заседании диссертационного совета Д 212.232.45 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу:198504, Санкт-Петербург, Петродворец, Ульяновская ул. 1, малый конференц-зал.С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Горького СПбГУ поадресу:199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9.Диссертация и автореферат размещены на сайте www.spbu.ruАвтореферат разослан «»г.Ученый секретарьдиссертационного советаД 212.232.45доктор физ.-мат. наук, доцентСухомлинов В.С.2ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность работы. В последние десятилетия методы флуоресцентной и колебательной спектроскопии, применяемые для исследования вещества являются универсальными чувствительным инструментом для решения задач исследований структуры биомолекул[1–3].С другой стороны, в исследованиях биомолекул активно применяются плазмонные материалы, созданные на базе благородных металлов и меди, обладающие специфическими оптическими свойствами [4-6].

Данные материалы активно внедряются в методики колебательной и флуоресцентной спектроскопии, используемые для диагностики биомолекул [7, 8].Особый интерес представляет применение флуоресцентных и колебательных методик в исследованиях молекулярных систем и объектов нанометрового масштаба с использованиемдиполь-дипольных обменных энергетических процессов и явления плазмонного резонансадля анализа малых концентраций и единичных биомолекул.Однако, несмотря на активное применение оптических методов исследований для изучения широкого спектра модельных химических соединений и биомолекул, существует значительный интерес, как к применению уже имеющихся результатов теоретических и экспериментальных исследований, так и выявлению новых закономерностей и к разработке новыхметодов, для практического изучения биомолекул при наступлении различных патологий [912].Данная диссертационная работа направлена на:А) Экспериментальное изучение фотофизических процессов поглощения, флуоресценции, комбинационного рассеяния, с последующей оценкой энергетического обмена междунаночастицами (НЧ) серебра и молекулами красителей в модельных средах - пленках поливинилового спирта (ПВС), в том числе помещенных на шероховатых поверхностях стекла,допированных НЧ серебра.Б) Практическое применение методов флуоресцентной и колебательной спектроскопии,с использованием результатов модельных исследований, для анализа структуры и оптических свойств биомолекул при наступлении патологии, включая разработку новых оптических методик и подбор экспериментальных условий для исследования биомолекул, в томчисле короткоживущих.Цель работы заключается в экспериментальном и теоретическом изучении фотофизических процессов с участием НЧ серебра, биомолекул и красителей на поверхности твердоготела, в полимерных матрицах и в растворах; использовании выявленных закономерностей иэкспериментальных параметров для анализа структуры и оптических свойств биомолекулпри патологиях, а также создания новых методик.Для достижения цели были поставлены следующие задачи:31.

Изучить безызлучательные процессы переноса электронной энергии в области металлусиленной флуоресценции между адсорбатами молекул родамина 6Ж и НЧ серебра на шероховатом стекле, в том числе на подвергнутом процессу низкотемпературного термическоговоздействия (до 350°С), а также в пленке ПВС.2. Провести теоретическую оценку степени усиления комбинационного рассеяния светаи параметров металл-усиленных флуоресценции и поглощения Р6Ж и НЧ серебра, а такжепараметров переноса энергии в модельных средах: пленках ПВС и на поверхностях шероховатого стекла.3. Методами колебательной и флуоресцентной спектроскопии, исследовать конформационное состояние вторичной структуры белковых молекул по группам Амид I, II, III сывороточного альбумина человека (САЧ) в норме и при патологии (сепсис), в растворе и адсорбированных на структурированной серебряной поверхности, в том числе с применением математических методов разрешения спектрального сигнала.4.

Выполнить расчеты коэффициентов усиления комбинационного рассеяния света длямолекул белка, адсорбированного на наноструктурированных серебряных пленках.5. Выполнить расчет параметров анизотропии флуоресценции молекул белка в норме ипатологии, а также оценить с их помощью степень конформационных изменений молекулбелка при наступлении патологии (сепсис).6. Разработать экспериментально-теоретический подход к исследованию концентрациймолекул АТФ методом конфокальной микроскопии в эритроцитах и митохондриях.Положения, выносимые на защиту:1. Механизм усиления КР света, позволяющий достичь коэффициента усиления КР10 степени в области металл-усиленной флуоресценции и поглощения, с участием молекул4Р6Ж и НЧ серебра в пленке ПВС на шероховатом стекле, подвергнутом процессу низкотемпературного (до 350ºС) термического спекания.2. Положение спектрального максимума группы Амид I, характеризующее переходСАЧ к неупорядоченной укладке вторичной структуры, определяемые с помощью математических методов обработки спектрального сигнала.3.

Конформационные изменения белковых молекул САЧ, возникающие вследствиеналичия патологии «сепсис», определяемые с помощью колебательной и флуоресцентнойспектроскопии в растворе и на структурированной серебряной шероховатой поверхности.4. Флуоресцентный метод для количественного определения концентрации молекуладненозинтрифосфата в клетках крови и митохондриях с точностью до 0,01 мг/мл.Научная новизна:1.

Получены новые результаты экспериментальных исследований по биосовместимыммодельным матрицам шероховатого стекла и ПВС с внедренными в них НЧ серебра и безНЧ. Показано, что оптическая спектроскопия адсорбатов молекул красителей и НЧ серебра в4пленках ПВС и на поверхности шероховатых стекол, в том числе подвергнутых низкотемпературному термическому отжигу, позволяет получить и оценить эффективность обменаэнергией по модели Фёрстера, между электронно-возбужденными и невозбужденными молекулами в среде.2. Показано, что при наличии НЧ серебра и молекул красителей в матрице ПВС возникают центры поглощения и рассеяния электронной и колебательной энергии.

При этомнаблюдается усиление флуоресценции и поглощения молекул. Экспериментально установлено, что модифицированные НЧ серебра шероховатые стекла позволяют усилить поверхностными плазмонами НЧ серебра сигнал КРС на молекулах Р6Ж (до 104).3. Впервые экспериментально, с применением методов флуоресцентной и колебательной спектроскопии, исследована вторичная структура белковых молекул при патологии(сепсис), в растворе и адсорбированных на структурированной серебряной поверхности, втом числе путем определения параметров энергетического обмена белковой молекулы в присутствии НЧ серебра. Показано, что количество α-трубчатых слоев в молекуле белка уменьшается и молекула претерпевает конформационные изменения ее вторичной структуры.

Показано увеличение флуоресценции аминокислотных остатков триптофана (Trp) вследствиевыхода остатков Trp на поверхность белковой глобулы.4. Предложена последовательность применения алгоритмов математической обработки для разрешения ИК-спектров и выделения сдвигов в характеристических полосах амидных групп.5. Впервые предложен неинвазивный адресный флуоресцентный метод оценки in vitroконцентрации короткоживущих молекул АТФ в клетках крови и митохондриях пациентовдля прогнозирования степени тяжести побочных реакций при проведении химиотерапииострых лимфобластных лейкозов.Научная и практическая значимость работы:1.

Эффект контролируемого плазмонного усиления КР, регистрируемый на синтезированных наноструктурированных поверхностях шероховатого серебра может быть использован в колебательной спектроскопии белков для анализа их конформационных особенностей.2. Предложенная последовательность применения алгоритмов математической обработки ИК-спектров может быть использована для разрешения сигналов в спектральном анализе белковых молекул, клеток.3.

Полученные закономерности в результате применения металл-усиленной флуоресценции и анизотропии в комплексе НЧ-белок в растворе могут быть использованы для анализа вторичной структуры белковых молекул путем оценки параметров энергетического обмена в комплексе НЧ-белок и коэффицента вращательной диффузии белковой молекулы.54. Предложенный адресный неинвазивный флуоресцентный метод оценки концентрации короткоживущих молекул АТФ в клетках крови и митохондриях пациентов in vitro может быть использован в медицине для оценки состояния пациентов, получающих химиотерапию, при лечении острого лимфобластного лейкоза.Степень достоверности результатов проведенных исследований обеспечиваетсятщательной и глубокой проработкой литературных данных по теме диссертации с последующей постановкой актуальных экспериментов, а также применением современного инструментария для достижения целей и задач диссертации, публикацией основных положенийдиссертации в рецензируемых журналах, в том числе международных изданиях.