Отзыв официального оппонента 2 (Хромосомная, клеточная и тканевая специфичность гидроксиметилирования ДНК в проэмбриональный и эмбриональный периоды развития человека)

официального оппонента на работу А.В. Тихонова «хРОмосомнАя, клеточнАЯ и ткАневАя специфичность гидРОксиметилиРОвАния днк В пРОзмБРИОИАльный и эмБРЙОнАльный пеРНОды РАЭВития челОВекА», представленной на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.02.07— генетика. Актуальность диссертационной работы А.В. Тихонова «Хромосомная, клеточная и тканевая специфичность гидроксиметилирования ДНК в проэмбриональный и эмбриональный периоды развития человека» не вызывает сомнений.

Одной из центральных проблем биологии развития является необходимость понять, почему, начиная с процессов оплодотворения, на протяжении всего эмбриогенеза и дальнейшего постнатального развития вплоть до смерти определенные клетки включают и выключают специфические гены. Как формируется многоклеточный организм с огромным количеством разнодифференцированных тканей и органов из одной оплодотворенной яйцеклетки? На многие вопросы пока нет конкретных ответов, но представленная диссертация А.В. Тихонова позволяет понять ряд важнейших эпигенетических процессов, происходящих в течение оогенеза, сперматогенеза, после оплодотворения и в раннем эмбриональном развитии человека.

Понятно, что дифференциальная экспрессия генов — это генетическая основа развития живых организмов, которая необходима для достижения и поддержания взрослых стадий. А процессы дифференцировки и межклеточных взаимодействий регулируют эмбриональную программу генной экспрессии, Важную роль при этом играют эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов, к которым относятся гетерохроматизация, преобразование гистонового кода, метилирование и деметилирование ДНК, интерференция РНК.

Как показали последние исследования, старение и многие заболевания также тесно связаны с наследуемыми в клеточных поколениях изменениями экспрессии генов. Процессы метилирования и деметилирования имеют волнообразный характер на протяжении всего онтогенеза, что хорошо показано в представленной диссертации. Важно отметить, что особенности метилирования часто наследуются в следующих поколениях. Достоверность научных результатов подтверждается большим объемом экспериментальных данных, документированных микрофотографиями, использованием многочисленных методических приемов с учетом правильной организации экспериментов, и применением современных методических подходов, таких как иммунофлуоресцентная детекция 56гпС (гидроксиметилирования ДНК) и 5гпС (метилирование цитозина), флуоресцентная гибридизация ~п з)то (РЬН).

Экспериментальные данные обработаны методами биологической статистики с использованием различных современных программных обеспечений и достоверны. Диссертация оформлена в соответствии с требованиями, предъявляемыми к диссертациям на соискание ученой степени кандидата наук, и включает в себя следующие разделы: список сокращений, введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение, выводы, список литературы. Работа изложена на 129 страницах, содержит 4 таблицы, 25 рисунков. Во введении автор аргументировано представляет современные представления об эпигеноме как пластичной и динамичной системе, способной к запрограммированным и спонтанным изменениям.

Хотя автор довольно категорично утверждает, что генетическая информация одинакова во всех клетках организма на протяжении всего онтогенеза, в отличие от эпигенетической модификации генома, что с моей точки зрения не совсем так. Репрограммирование эпигенома происходит в гаметогенезе и раннем эмбриогенезе волнообразно, что является одним из важных механизмов удаления предсуществующие эпигенетические паттерны для установления новых. Важную роль в эпигенетических преобразованиях играют 5- метилцитозин и продукт его окисления гидросиметилцитозин, исполняющего роль деметилирования ДНК, необходимого для эпигенетического репрограммирования генома гамет и эмбрионов. Автор поставил основную цель исследования — изучить последовательные изменения особенностей гидроксиметилирования ДНК в период оогенеза, сперматогенеза, до - и постимплантационного эмбриогенеза человека.

В главе «ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР» Андре Владимирович в соответствии с названием диссертации дает подробную характеристику процессов метилирования и деметилирования как в процессе гаметогенеза, так и раннего эмбриогенеза. Интересен факт, что межаллельные различия в импринтированных генах вызваны метилированием ДНК, и возникают они в гаметогенезе (Паткин, 2008). Важно отметить, что процесс метилирования пассивно или активно обратим и часто реализуется после репликации ДНК.

Несмотря на то, что биологическая роль гидроксиметилирования еще недостаточно изучена, уже по данным литературы понятно, что в основе этого феномена лежит процесс деметилирования ДНК. Достаточно информативен раздел о влиянии внешних факторов на гаметогенез и эмбриогенез, при котором может возникнуть аберрантное метилирование, приводящее к нарушениям первичной дифференцировки клеток и другим постнатальным потологиям (уаоКе1а!., 2008). Достаточно подробно освещены процессы сперматогенеза и оогенеза, доимпдантационное и постимплантационное развитие зародыша человека.

Литературный обзор написан хорошим языком и полностью отражает изучаемую проблему. В Главе 2 вМАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ» очень подробно на 11 страницах представлены методы приготовления препаратов хромосом и интерфазных ядер из неоплодотворенных яйцеклеток, зигот и бластомеров доимплантационных зародышей человека, из фрагментов тестикулярной ткани, ворсин хориона и фрагментов эмбриональных органов, гистологических препаратов из биоптата тканей семенника, из образцов эякулята.

Было проведено иммунофлуоресцентное окрашивание цитогенетических и гистологических препаратов с помощью антител к 5ЬпС и 5гпС с целью определения плоидности интерфазных ядер на препаратах проводили флуоресцентную гибридизацию !и з!Ш (Р!5Н). Анализ препаратов и получение фотоизображений проводили с использованием флуоресцентных микроскопов. Детально было исследовано измерение интенсивности флуоресцентного сигнала после иммунофлуоресцентной детекции 5ЬпС и 5гпС на метафазных хромосомах зигот на цифровых фотоизображениях с помощью программы !гпа8е ! 1.49и. Убедительно была проведена статистическая обработка данных с помощью программ Мат)зиса 8,0 и бгарЬРадРг!згп 6.01.

Единственное замечание, что при культивировании яйцеклеток и доимплантационных зародышей не указано название питательной среды. Глава 3 кРЕЗУЛЬТАТЫ» содержит 3 основных подраздела, характеризующих распределение 5ЬпС и 5гпС в геноме предимплантационных зародышей человека, в половых клетках и у эмбрионов 5-12 недель развития. Такая последовательность изучения процессов метилирования и деметилирования, как оказалось, имеет свою логику. Распределение 5йтС и 5тС в геноме зародышей человека на доимплантационных стадиях развития. Исследования были проведены на зиготах, бластомерах, трехклеточных, 5-, 8-клеточных зародышей и на бластоцистах. Самая интересная стадия — зигота, поэтому остановлюсь на ней подробнее. Через 2-3 часа после оплодотворения в зиготе начинаются сложнейшие преобразования как в мужском, так и в женском пронуклеусах.

На метафазных хромосомах зигот диссертант исследовал распределение иммунофлуоресцентной детекции с помощью специфичных антител к гидроксиметилированному и метилированному цитозину. Были получены интересные результаты по особенностям гипергидроксиметилирования и гипометилированния хромосом материнского и отцовского происхождения, Я когда-то занималась изучением синтеза ДНК в зиготах кролика.

Мы показали, что ДНК-репликативные процессы функционально связаны морфологическими изменениями в пронуклеусвх кролика. В начале 5-фазы мужской пронуклеус обладает более сильно выраженной репликативной активностью, а во второй половине 5-периода мужской пронуклеус становится больше женского, но интенсивность синтеза ДНК затухает. Мы выявили два типа хроматина, отличающиеся по времени репликации ДНК.

В этой связи было бы интересно посмотреть процессы репрограммирования генома не только в хромосомах, но и в пронуклеусах на разных временных этапах. Автор получил интересные данные о сегментоспецифичном распределении 5йгпС в хромосомах, а главное — хромосомы отцовского происхождения гипергидроксиметилированы и гипометилированы по сравнению с хромосомами материнского происхождения. В процессе дробления, уже со стадии трех бластомеров начинается ассиметричное постепенно затухающее распределение 56тС, что отчасти, по мнению диссертанта, связано с сестринскими хроматидными обменами и репликационными процессами. Первая дифференцировка клеток проходит в бластоцисте и диссертант показал, что высокое содержание 5пгпС локализовано в ядрах клеток внутренней клеточной массы, дающей начало развитию эмбриона, что косвенно может указывать о связи процессов метилирования и гидроксиметилирования с первичной дифференцировкой клеток в эмбриогенезе. Гидроксиметилирование и метилирование ДНК половых клеток человека.