Отзыв ведущей организации (Хромосомная, клеточная и тканевая специфичность гидроксиметилирования ДНК в проэмбриональный и эмбриональный периоды развития человека)

«УТВЕРЖДАЛО» Директор ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» доктор биологических наук, профессор РАН А.В. Дчнт~йав:; " ':.~Ч1~'=,— -=.. --...,. «~ ~~,"~а~ф..„.': „"" ':~':- 'ж,. 20! 8 г. ОТЗЫВ ведущего учреждения на диссертацию Тихонова Андрея Владимировича "ХРОМОСОМНАЯ, КЛЕТОЧНАЯ И ТКАНЕВАЯ СПЕЦИЕИЧНОСТЬ ГИДРОКСИМЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК В ПРОЭМВРИОНАЛЬНЫЙ И ЭМБРИОНАЛЬНЫЙ ПЕРИОДЫ 1 АЗВИТИЯ ЧЕЛОВЕКА", представленную на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.02.07 — генетика. Актуальность темы Работа Тихонова Андрея Владимировича посвящена крайне актуальной теме, а именно изучению эпигенетнческих механизмов регуляции активности генов в проэмбриональном и эмбриональном периоде развития человека.

Особое внимание уделено наименее изученному вопросу относительно гидроксиметилирования ДНК в сравнении с метилированием ДНК на хромосомном, клеточном и тканевом уровнях. Кроме того, к настоящему времени все более общепринятым становится взгляд, согласно которому отклонения от нормы в эпигенетическом и эпигеномном маркировании, в первую очередь, метилировании ДНК, в ходе самого раннего развития связаны с появлением 1 "взрослых" заболеваний. Недавно появились данные, что указанные процессы дифференцировки связаны с динамическим изменениями не только метилирования, но и гидроксиметилирования ДНК. Образование гидроксиметилцитозина, как установлено, связано с процессом активного деметилирования ДНК.

В этой связи крайне актуальным является вопрос о том, каким образом в структуре хромосом и модификациях хроматина отражается дифференциальная активность генов и целых их кластеров, чему в значительной степени и посвящена работа Л.В,Гихонова. Остается неясным, каким образом на уровне метафазных хромосом осуществляется эпигенетический "ЬоойпагЫщ" транскрипционно активных районов хромосом, как он меняется в ходе первичной дифференцировки в дои мплантационном развитии„имеются ли какие-либо специфичные хромосомные участки, различающиеся по уровню метилирования в ходе дифференцировки, или, картина распределения метилцитозина и гидроксиметилцитозина вдоль хромосом не меняется.

Основные сведения по этой проблематике получены на модельных организмах, а для человека таких данных крайне мало, Данные о динамике активного деметилирования в раннем эмбриогенезе человека на сегодняшний день отсутствуют. Информация об этом процессе имеет как фундаментальную, так и практическую ценность, в связи с тем, что нарушения процессов эпигенетической реорганизации генома половых клеток и доимплантационных зародышей могут препятствовать нормальному эмбриогенезу и приводить к остановке развития. Поэтому представляется логичной и актуальной основная цель автора «изучение специфичности распределения 5гпС и 5Ь1пС в ДНК в проэмбриональном и доимплантационном периодах развития человека», и соответствуюшие задачи по локализации участков метил- и гидроксиметилцитозина в хромосомах.

Научная новизна исследования, полученных результатов и выводов Впервые проведен анализ гидроксиметилирования ДНК метафазных хромосом половых клеток, зигот, бластомеров дробящихся зародышей и и экстраэмбриональных тканей э~бр~ональны~ постимплантационных зародышей человека. Установлено, что на стадии зиГОты имеет место асимметричность актиннОГО деметилирования отцовского и материнского геномов, то есть, метафазные хромосомы отцовского происхождения подвергаются активному деметилированию с образованием 5ЬтС сильнее„чем метафазные хромосомы материнского происхождения.

Гидроксиметилированная ДНК неравномерно распределена в метафазных хромосомах зигот. При делениях дробления вплоть до стадии бластоцисты происходит пассивная потеря 51зтпС с образованием ГемиГидроксиметилированных хромосом и сохранением привлечено большое количество данных литературы. Сформулированные в 3 сегментоспецифичного распределения 5ЬпС в гидроксиметилированных хроматидах. Получены уникальные данные о межхромосомных, межклеточных и межтканевых различиях гидроксиметилирования ДНК метафазных хромосом эмбрионов человека 5-12 недель развития, обусловленные случайным сочетанием гидроксиметилированных, гемигидроксиметилированных и негидроксиметилированных сестринских хроматид и гомологичных хромосом.

Впервые установлена связь между параметрами спермограммы и характером гидроксиметилирования сперматозоидов в эякулятс: увеличение доли гидроксиметилированных сперматозоидов ассоциировано со снижением качества эякулята и нарушениями фертильности. Обоснованность н достоверность научных положений, выводов и рекомендаций, сформулированных в диссертации Значительный объем подтверждает достоверность полученных результатов.

В данной диссертационной работе осуществлен подробный статистический анализ данных, что определяет высокую степень достоверности полученных результатов. Для интерпретации результатов работе выводы являются итогом анализа и обобщения результатов исследования. Полученные в ходе работы результаты опубликованы в виде 7 научных статей в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах и 11 тезисных сообщений.

Материалы работы были представлены на трех международных и одной российской конференциях, Выводы, сформулированные в диссертации, основаны на достаточном объеме наблкэдений и аргументировано доказываются соответствующими исследованиями. Практические рекомендации обоснованы фактическим материалом, их достоверность не вызывает сомнений и отражает суть проведенного научного исследования и полученных достижений. Тема представленной диссертационной работы Тихонова Андрея Владимировича полностью отвечает требованиям по специальности 03.02.07 — генетика.

Общая характеристика диссертационной работы Диссертация изложена на 129 страницах и включает следующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Материал и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Заключение», с<Выводы» и «Список литературы». Работа иллюстрирована 25 рисунками и 4 таблицами. Список литературы содержит 291 источник. В соответствии с темой диссертации построен литературный обзор, в котором автор анализирует современное состояние исследований в области метилирования ДНК, 5-гидроксиметилирования, возникающего в ходе активного деметилирования. Проанализированы основные молекулярные механизмы как метилирования, так и деметилирования в ходе гаметогенеза и эмбриогенеза.

Описана роль гидроксиметилцитозина в регуляции активности генов. Очень ценным является, что автор уделяет внимание роли внешних факторов 1токсикантов) в репрограммировании генома на основе эпигенетических механизмов. В соответствии с темой работы в обзоре рассматриваются основные механизмы сперматогенеза, оогенеза, до — и постимплантационного развития человека. Таким образом, обзор литературы 4 приводит автора к обоснованному заключению о недостаточности данных об эпигенетических особенностях генома гамет и эмбриона человека и необходимости дальнейших исследований механизмов репрограммирования генома человека в гаметогенезе и эмбриогенезе как для понимания фундаментальных проблем биологии развития, так и для решения актуальных задач медицинской генетики, в том числе и с широким использованием современных вспомогательных репродуктивных технологий.

В целом обзор прекрасно написан и, конечно, может быть использован при преподавании соответствующих курсов, Единственное замечание относиться к рисунку 1, в котором непонятно, какая из 0ХМТ имеется в виду, В главе "Материал и методы" автор подробно описывает как материал исследования, так и использованные методы.

Описаны методы приготовления препаратов метафазных хромосом и интерфазных ядер из неоплодотворившихся яйцеклеток, зигот и бластомеров доимплантационных зародышей человека, Приготовления цитогенетических препаратов из фрагментов тестикулярной ткани„ворсин хориона и фрагментов эмбриональных органов, приготовления гистологических препаратов из биоптата тканей семенника„ приготовления препаратов из образцов эякулята. Все эти методы описаны подробно, что дает возможность оценки в дальнейшем адекватности использованных методов окрашивания. Использовано "классическое" ОГН-окрашивание цитогенетических препаратов яйцеклеток, зигот, бластомеров доиплантационных зародышей и сперматогенных клеток человека, иммунофлуоресцентное окрашивание цитогенетических и гистологических препаратов с помощью антител к 5ЬпзС и 5пзС, флуоресцентная гибридизация ш з1ш (Г1КН).

Автор также использовал измерение интенсивности флуоресцентного сигнала после иммунофлуоресцентной детекции 5ЬтС и 5тС на препаратах. То есть, как методы приготовления препаратов, так и визуализации сигналов являются современными и адекватными поставленным задачам. Основные полученные результаты представлены в виде 15 микрофотографий и ряда графиков, показывающих результаты количественных исследований. К сожалению, в силу практической недоступности половых клеток, зигот и доимплантационных зародышей человека, работа была в основном проведена на анормальном материале, что, видимо, и обусловило недостаточно высокое качество ряда микрофотографий.

Возможно, что недостаточное качество хромосом связано с тем, что автор не использовал при приготовлении хромосомных препаратов цитостатики, как, например, колцемид. Понятно, что при наблюдении в микроскоп, картина является более четкой. Кроме того, видимо, имело смысл сделать микрофотографии как общих планов метафазных пластинок, так и представить отдельные фрагменты с большим увеличением, чтобы более доказательно утверждать ряд заключений автора, Тем более, что в ряде случаев это было сделано. Тем не менее, обнаруженные автором основные закономерности репрограммирования с участием 5шС и 5ЬгпС у человека сходны с таковыми у грызунов, что также указывает на достоверность полученных результатов„как и проведенная статистическая обработка.

Ряд особенно интересных результатов был отмечен вьш~е. Очень хорошо написана глава «Обсуждение». Диссертационная работа написана литературным языком, достаточно легко читается. Представленный материал в таблицах и рисунках удобен для восприятия и анализа. Выводы логично вытекают из содержания диссертации, обоснованы и полностью соответствуют поставленным целям и задачам исследования. Практические рекомендации сформулированы четко и понятно, что позволяет использовать их в практической работе.