Автореферат (Ранние молекулярные и клеточные события формирования мезодермы у нереидных полихет), страница 4
Описание файла
Файл "Автореферат" внутри архива находится в папке "Ранние молекулярные и клеточные события формирования мезодермы у нереидных полихет". PDF-файл из архива "Ранние молекулярные и клеточные события формирования мезодермы у нереидных полихет", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "биология" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве СПбГУ. Не смотря на прямую связь этого архива с СПбГУ, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата биологических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст 4 страницы из PDF
Все варианты мутаций приводили к сдвигу рамки считывания и,следовательно, нокауту Pdu-twist (Рис. 4). Эти результаты дают уверенность впродуктивности апробированного метода и являются первым этапом для получениянокаутной линии животных.Рис. 4. Выравнивание ампликонов первого экзона Pdu-twist, полученных после ПЦРскрининга TALEN-индуцированных мутаций. Положение TALEN twi-3L/R показано краснымиблоками сверху на последовательности дикого типа (WT), рестрикционный сайт BamHI в спейсере– циановым. Несовпадающие с диким типом позиции выделены зеленым, отсутствующиенуклеотиды – знаком -, обозначение мутаций приведено слева: за префиксом Δ- указана длинаделеции в bp, перед аббревиатурой SNV (single nucleotide variant) приведено количествонуклеотидных замен.Спецификация и паттернирование мезодермы.
Энтомезодерма A. virens, каки у других нереид, происходит из бластомера 4d. В результате его билатеральногоделения образуются М-клетки, лежащие на дорсальной границе презумптивногобластопора (Рис. 5). По результатам гибридизации in situ наиболее ранним маркеромэтой клеточной линии является Avi-twist. В ходе дробления мРНК Avi-twistпреимущественно локализуется в свободной от желтка цитоплазме в различныхбластомерах D квадранта, но в конце этой фазы развития экспрессия выявляетсяисключительно в клетках М. К началу гаструляции транскрипты Avi-twistпоявляются еще в четырех крупных клетках края бластопора – микромерах 3a–3d(Рис. 5Б), которые представляют собой полный набор эктомезодермальныхпредшественников. Таким образом, Twist у A.
virens проявляет панмезодермальнуютканеспецифичность, что установлено для регуляторного гена Spiralia впервые.Циркумбластопоральная активность этого регуляторного фактора не была показанав развитии ни одного из моллюсков и аннелид ранее, но похожий паттерн выявленна стадии гаструлы у брахиоподы (Passamaneck et al., 2015). Эти данные12поддерживают идею, что закладка мезодермы по краю бластопора эволюционнопервична (анцестральна) для Bilateria (Lartillot et al., 2002; Martindale et al., 2004).Кроме того, на основе значительного консерватизма паттернов экспрессии ифункции Twist у Bilateria, можно предположить, что у нереид материнские продуктыTwist участвуют в автономной спецификации энтомезодермы.Рис.
5. Морфогенез и молекулярное паттернирование мезодермы у A. virens. Отображенытолько мезодермальные домены экспрессии Twist (красный), Evx (голубой), Mox (зеленый), Vasa(синий градиент), PL10 (желтый), Piwi (розовый градиент). Области перекрывания экспрессииTwist и Evx показаны фиолетовым, Twist и Mox – коричневым. Стадия развития указана подкаждым изображением. А, Б – вегетативная проекция, дорсальная сторона снизу, экспрессиянаблюдается в клетках-основательницах энтомезодермы (бластомеры 4d и М) и эктомезодермы.Макромеры на дне бластопора (серая заливка) и мезодерма интернализуются в ходе гаструляции13за счет обрастания эктодермой (белая заливка). Пунктиром на Б обозначены вентральный илатеральные края бластопора.
В–И – вентральная проекция, анимальный полюс вверху. В –пролиферация М-клеток дает начало мезодермальным полоскам (МП), которые распространяютсявперед, экспрессируя Evx (во всех клетках) и Twist (в отдельных клетках по всей длине МП). Г, Д,Ж–И – у трохофор количество мезодермальных клеток продолжает увеличиваться, МПразрастаются латерально (вдоль дорсовентральной оси). Twist и Mox экспрессируются вперекрывающихся энтомезодермальных доменах, демонстрируя метамерный билатеральныйпаттерн (Г, Д).
Ж–И – Vasa и Piwi имеют встречно направленные градиенты экспрессии в МП,сигнал PL10 распределен по мезодерме равномерно. Е – к стадии ранней метатрохофоры доменыэкспрессии Twist и Mox в энтомезодерме сегрегируются и более не пересекаются.Эктомезодермальная экспрессия обозначена белым треугольником, Х – вегетативный полюс,звездочка – область стомодеума, пт – прототрох, хм – хетоносный мешок.Начиная со стадии гаструлы, мезодермальные зачатки обнаруживают у A.virens динамично меняющийся во времени молекулярный профиль. Мы наблюдалипоследовательную активацию экспрессии Avi-twist, Avi-evx, Avi-vasa, Avi-pl10, Avipiwi1, Avi-piwi2 и, наконец, Avi-mox в развивающихся МП (Рис.
5). На стадияхпротрохофоры–раннейтрохофорытранскрипты всех изученных геновдифференциально распределены в пределах частично перекрывающихся доменов.ДляAvi-twistиAvi-moxхарактернаисключительномезодермальнаятканеспецифичность, тогда как остальные гены интереса проявляют своюактивность еще и в эктодермальных зачатках. Наблюдаемая картина сложногосочетания мезодермальных доменов экспрессии должна отражать раннююгетерогенность морфологически недифференцированных МП. По-видимому, этотдифференциальный молекулярный статус различных областей МП является основойдля дальнейшей сегрегации мезодермальных линий у более зрелых личинок. Идействительно, у средних трохофор перекрывание доменов экспрессии становитсязначительно меньше, а у ранних метатрохофор паттерны активности гомологовTwist, Mox, Evx и вовсе не пересекаются в пределах энтомезодермы.
Несколькоиначе происходит индивидуализация паттернов экспрессии гомологов Vasa, PL10,Piwi: к стадии ранней метатрохофоры уровень их активности заметно снижается;встречно направленные вдоль МП градиенты экспрессии Avi-piwi1 (переднезадний)и Avi-vasa (заднепередний) затухают; появляются признаки метамерности сигнала сего наибольшей интенсивностью в доменах, частично или полностью повторяющихэкспрессию Avi-twist.Таким образом, очевидно, что динамика экспрессии избранных генов интересаотражает прогрессивную детерминацию различных мезодермальных зачатков. Этапространственная неоднородность вдоль переднезадней оси МП может бытьпродемонстрирована экспрессией Avi-piwi1 и Avi-vasa. Различная судьба клеток МПвдоль дорсовентральной оси, вероятно, обуславливается размежеванием областейактивности Avi-twist (экспрессируется в латерально расположенных зачаткахпараподиальных мышц) и Avi-mox (преобладает на вентральной стороне на местеразвития косых мышц и/или целомических мешков).
Весьма похожий переход отперекрывающихся к неперекрывающимся паттернам экспрессии Twist и Moxпроисходит в развитии ланцетника (Yasui et al., 1998; Minguillón, Garcia-Fernàndez,2002) и брахиоподы (Passamaneck et al., 2015). У морского ежа, по-видимому,аналогичный процесс сегрегации мезодермальных зачатков начинается уже на14стадии ранней гаструлы (Andrikou et al., 2013). Примечательно, что специфичностьрегуляторных генов-участников у зародышей иглокожих мало сопоставима с тем,что наблюдается у спиралий (к примеру, транскрипты Twist выявляются вцеломических мешках, а Mox и вовсе не экспрессируется в мезодерме).Следовательно, создание таксон-специфичного набора мезодермальных зачатковмогло идти независимо в разных филогенетических линиях с привлечениемразличных управляющих генов.
Однако в целом среди этих регуляторных геновпрослеживается определенное единообразие: одни и те же мезодермальные факторызачастую используются дальнеродственными организмами. При этом максимальноесходство специфичности наблюдается сразу после обособления мезодермы (вовремя гаструляции) и при сравнении наиболее медленно эволюционировавших, т.е.наиболее базальных, таксонов (антозои среди книдарий, эррантные полихеты средианнелид, головохордовые среди хордовых и т.д.). Проверенный набор регуляторныхгенов продемонстрировал высокую степень консерватизма мезодермальнойтканеспецифичности среди Spiralia.
Это позволяет нам с уверенностью включитьэти факторы в состав анцестральной программы развития мезодермы спиралий.Изучение эволюционных преобразований данной морфогенетической программыявляется, по нашему мнению, отправной точкой для объяснения разнообразияуровней организации мезодермальных тканей Spiralia.В связи с проблемой сегментации мезодермы аннелид нами получены новые ивесьма ценные сведения. В ходе развития энтомезодермальные паттерны активностигомологов Twist, Mox, Vasa и Piwi метамеризуются в гипосфере трохофоры A. virens(Рис.
5). Вместе с известным посегментным распределением продуктов другихрегуляторных генов (Engrailed, Gbx, некоторые Hox и NK) эти молекулярные данныеуказывают на скрытую метамерную организацию первичной трохофорной личинки.Мы полагаем, что циркумбластопоральная закладка и ранняя метамеризациямезодермы нереид отражает эволюционную историю формирования третьегозародышевого листка и подтверждает, что общий предок трехслойных уже имелсегментированный целом. Наши данные поддерживают архицеломатнуюэволюционную гипотезу (Sedgwick, 1884), по которой круговое расположение камеркишечной полости (цикломерия) у радиально-симметричных предковых формпревратилось в метамерию первичных Bilateria.Роль МАР-киназного сигналинга в формировании мезодермы.
Пополученным нами данным МАР-киназный сигнальный путь играет важную роль враннем развитии нереид. мРНК гомологов MAPKK (Mek) и MAPK1/2 (Erk1/2) –ключевых терминальных элементов MAPК сигналинга – присутствует примерно наодном и том же уровне на протяжении всего эмбрионального и личиночногоразвития P. dumerilii. Иммуноцитохимически была описана активность МАР-киназыв определенных клеточных линиях ранних зародышей А. virens.