Автореферат (Ранние молекулярные и клеточные события формирования мезодермы у нереидных полихет), страница 3

клетки,содержащие эндогенную мРНК). Гибридизацию с зондом проводили при +65°С 1–2дня, после чего инкубировали зародыши в антителах против дигоксигенина,конъюгированных с щелочной фосфатазой. Для проявления сигнала использовалисубстрат BCIP/NBT. Иммуноцитохимическое выявление белков проводили сфлуоресцентными антителами.Последовательности генетических локусов определяли секвенированиемВАС-клонов. Для этого в геномной ВАС-библиотеке A. virens с помощью саузернгибридизации с зондом из кДНК находили нужные клоны и проверяли ихрестрикционным анализом. Воссоздание последовательности гДНК из контиговдополнялосьсеквенированиемBACпоСэнгеру,сравнениемспоследовательностями из базы данных генома P. dumerilii и предсказанием CDS вгДНК in silico с последующей ПЦР со специфическими праймерами исеквенированием продуктов, а также TAIL-ПЦР.Анализ генов интереса проводили с помощью программ CLC Main Workbench,BioEdit, ApE и on-line сервисов BLAST, SIM4, Splign, FGENESH, Augustus, Mulan,REPFIND, UTRSite, Pfam, PROSITE.

Филогенетический анализ осуществляли насервере Phylogeny.fr. Аминокислотные последовательности ортологов выравнивалипо алгоритму MUSCLE 3.7 и строили дендрограмму методом максимальногоправдоподобия PhyML 3.0 с aLRT-тестом.Для подбора перспективной стратегии трансгенеза у P. dumerilii проверялиактивность транспозазы Mos1 in vivo. Для этого в зиготы инъецировали плазмиднуюДНК вектора-донора с или без мРНК транспозазы.

Характер вырезания трансгена извектора анализировали с помощью гнездовой ПЦР на инъецированных зародышах,клонирования, секвенирования и выравнивания ампликонов. Для расшифровкипоследовательности ДНК, граничащей с интегрированным в геном P. dumeriliiтрансгеном на основе транспозона Mos1, из червей линий tuba::egfpvbci1 и r8opsin::egfpvbci2 выделяли гДНК и использовали в 4 сериях TAIL-ПЦР. Ампликоны,клонировали, секвенировали и выравнивали с последовательностью вектора-донора.У P. dumerilii изучали регуляцию экспрессии гена Twist. С помощьюполуколичественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RTПЦР) был установлен относительный уровень экспрессии в ходе эмбрионального иларвального развития. Репортерную конструкцию для трансгенеза создавали попротоколу ВАС-рекомбинации. В идентифицированной ВАС с локусом Twist вкодирующуюобластьгенавстраивалипоследовательностьзеленогофлуоресцентного белка (GFP).

Препараты ДНК с рекомбинантной ВАСинъецировали в зиготы и анализировали экспрессию трансгена у зародышей иличинок прижизненно. Для отработки методов мутагенеза конструировали сайтспецифическиенуклеазыTALEN,способныенарушитькодирующуюпоследовательность Twist. В зиготы инъецировали синтезированную мРНК TALENи генотипировали зародышей и ювенильных червей с помощью ПЦР на гДНК.Модуляция MAP-киназного сигналинга проводилась в растворе MEKингибитора U0126 в период раннего развития A. virens – на стадиях дробления иначала гаструляции Объекты из эксперимента и контроля изучали насветооптическом уровне прижизненно, а также с помощью гибридизации in situ,морфометрии и статистической обработки.Результаты гибридизации in situ, иммуноцитохимии и экспериментов потрансгенезу анализировали с помощью методов световой, флуоресцентной илазерной конфокальной микроскопии.

Обработку иллюстративного материалапроводили в программах Adobe Photoshop CS 5.1, ImageJ, AxioVision 4.8, LAS AFLite, Microsoft Publisher 2010 и Adobe Illustrator CS 5.1.Результаты и обсуждениеМолекулярные регуляторы развития мезодермы нереид и используемыеметодические подходы для их анализа. По литературным данным был определеннабор генов интереса – возможных участников программы развития мезодермыSpiralia. У полихеты A.

virens были обнаружены и впервые проанализированыфрагменты генов Twist, Mox, Evx, Vasa, PL10 и Piwi, гомолог Twist был такжеидентифицирован и отклонирован для P. dumerilii. Из просеквенированных участковкДНК и гДНК были восстановлены полноразмерные последовательности,содержащие 5’ UTR, белок-кодирующую часть (CDS) и 3’ UTR для генов Twist, Evx,Vasa, и Piwi (Рис. 1).

Протяженные последовательности Mox и PL10 осталисьнеполными на 3’ конце. У обеих полихет было обнаружено по два паралогичныхгена Piwi (Piwi1 и Piwi2), для остальных генов удалось найти по одному гомологу.Идентифецированные гены A. virens были названы Avi-twist, Avi-mox, Avi-evx, Avivasa, Avi-pl10, Avi-piwi1 и Avi-piwi2.По построенным филогенетическим схемам можно судить, что для геновнереид в целом характерна короткая длина ветвей, что отражает малую степеньдивергенции этих последовательностей.

Топология дендрограмм Mox, Vasa, PL10 иPiwi показывает совместную кластеризацию гомологов Spiralia. Экзон-интронная идоменная структура изученных генов проявляет большой консерватизм –присутствуют характерные для каждого семейства функциональные домены;комплексное устройство генов с множеством экзонов отвечает анцестральному для9Metazoa типу организации генома (Raible et al., 2005).

Все исследованные гомологирегуляторных генов экспрессировались в мезодермальных зачатках, что указываетна их участие в программе развития.Рис. 1. Строение транскриптов проаналзированных генов интереса. Зелеными блокамиотмечена нетранслируемая часть (UTR), белок-кодирующая область (CDS) выделена оливковым,вертикальные линии внутри блоков маркируют границы экзонов. Красные блоки показываютучастки, кодирующие в белке консервативные домены. Цифрами обозначена длинапоследовательности кДНК в bp.С целью совершенствования методов анализа генов интереса на P. dumeriliiотрабатывали технологии транспозон-опосредованного трансгенеза.

В частностиизучали механизм транспозиции, т.е. параметры вырезания и встраиваниярепортерной конструкции на основе транспозона Mos1 в геном P. dumerilii.Проанализировав участки вектора-донора после вырезания транспозона (Рис. 2), атакже участки гДНК на границе наследуемых трансгенов, была установленанеобычная активность Mos1, не показанная ранее на других моделях.Неканонический характер работы Mos1 заключался в вариабельности границвырезания и встраивания трансгена с возможностью множественной интеграцииразличных фрагментов в один геномный локус. Это помогает объяснить невысокуюэффективность (<5%) трансгенеза P.

dumerilii с использованием Mos1 и делаеточевидным необходимость разработки более надежных технологий, например наоснове интегразы phiC31.10АБВРис. 2. Вырезание трансгена на основе транспозона Mos1 из вектора в зависимости отналичия транспозазы. А – строение трансгена, цифрами обозначена длина последовательности вbp. На границах трансгена расположены терминальные повторы (Mos1 TR, красные блоки),оканчивающиеся 3’ и 5’ инвертированными повторами (ITR). Трансген кодирует флуоресцентныемаркеры dsRed и GFP (оливковые блоки) и промоторную область гена Pdu-rps9 (циановый). Б –строение вектора-донора до и после вырезания трансгена.

Черные стрелки показывают положениепраймеров для скрининга. В – результаты гнездовой ПЦР на зародышах, инъецированныхвектором с (+ mos1) или без (– mos1) мРНК транспозазы. М – дорожка с маркером молекулярноговеса 2-Log (NEB), цифрами слева обозначена длина фрагментов ДНК в bp.В другом эксперименте нами впервые был проделан трансгенез P. dumerilii срекомбинантной ВАС, содержащей геномный локус A. virens. Репортерный трансгенобеспечил рекапитуляцию экспрессии гена Twist и в экто- и в энтомезодерме (Рис.3). По времени появления сигнала GFP можно судить о запуске зиготическойтранскрипции Twist, которая приурочена к началу гаструляции (9 чпо). Этот фактподтверждают и результаты RT-ПЦР.

Транскрипты Pdu-twist присутствуют еще внеоплодотворенном яйце, но со стадии гаструлы относительный уровень мРНКвозрастает в несколько раз, что указывает на активацию зиготической экспрессии.Рис. 3. Экспрессия трансгена Avi-twist::eGFP-F2A-NTR у средних трохофор P. dumerilii (36чпо). Прижизненные наблюдения, максимальная проекция конфокального Z-стека, каналыподписаны в верхнем правом углу: eGFP (зеленый), TRITC (красный). Вентральная проекцияодного и того же объекта в разных фокальных плоскостях.

Экспрессия еGFP вэнтомезодермальных клетка показана белыми стрелками, экспрессия в эктомезодерме –оранжевыми треугольниками, Х – вегетативный полюс (область проктодеума), звездочка – областьстомодеума. Масштаб 50 мкм.По протоколу совершенно нового метода обратной генетики полученыконструкции нуклеаз TALEN, специфичных к кодирующей области Pdu-twist. Нами11отрабатывались условия доставки мРНК TALEN в зиготы и методы скринингамутаций. Наиболее эффективная пара TALEN twi-3L/R обеспечила вероятностьполучения indel-мутаций от 17% до 51%. Эта конструкция обладала наиболеедлинными сайтами связывания ДНК-мишени (по 17 bp) и наибольшим спейсером(16 bp).