Автореферат (Генетические и эпигенетические особенности генома сперматозоида и их влияние на ранее эмбриональное развитие человека), страница 3
Описание файла
Файл "Автореферат" внутри архива находится в папке "Генетические и эпигенетические особенности генома сперматозоида и их влияние на ранее эмбриональное развитие человека". PDF-файл из архива "Генетические и эпигенетические особенности генома сперматозоида и их влияние на ранее эмбриональное развитие человека", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "биология" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве СПбГУ. Не смотря на прямую связь этого архива с СПбГУ, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата биологических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст 3 страницы из PDF
Формы головок сперматозоидов (ув. 10х100)двойнаяокруглаяточечная13Было показано, что в эякуляте пациентов с нарушением фертильностинаиболее часто встречаются сперматозоиды с аморфной и грушевиднойформами головок (Рис. 6).Рисунок 6. Частота встречаемости различных форм головок сперматозоидовв эякуляте пациентов с нарушением фертильностиПримечание: н – нормальная, н/п – небольшая патология, б – большая, м –маленькая, окр – округлая, ам – аморфная, гр – грушевидная, уд –удлиненная, дв – двойная, вак – вакуолизированная, т – точечная, п/ак – спатологией акросомыТаким образом, грушевидные и аморфные формы головоксперматозоидов можно рассматривать в качестве мажорных форм,характерных для сперматогенеза человека.
В таком случае, преобладание тойили иной формы головок сперматозоидов редко встречающихся в нормеможет свидетельствовать об изменении характера спермиогенеза и бытьсвязано с нарушением генома и эпигенома половой клетки.Наличиесвязимеждуморфологическимиособенностямисперматозоида и его геномом и эпигеномом представляет большойпрактический интерес. Так, наличие вакуолей в головке сперматозоидасвязывают с декомпактизацией ДНК, с нарушением соотношения гистонов ипротаминов и разрывами ДНК (Chemes and Rawe, 2003; Boitrelle, 2011;Bartoov, 2003; Boitrelle, 2011; deVos, 2013). Для проверки данногоутверждениябылапроанализированадолясперматозоидовсфрагментированной ДНК у пациентов, в эякуляте которых преобладалисперматозоиды с теми или иными патологическими формами головок.
Былоустановлено, что наибольшая доля сперматозоидов с фрагментированнойДНК характерна для пациентов, в эякуляте которых доминироваливакуолизированные формы головок (достоверно значимые отличия, ANOVA,p≤0,05) (Табл. 4). Также между этими параметрами была выявленаположительная корреляция (коэффициент корреляции Спирмена r=0,33,p≤0,05) (Рис. 7).14Таблица 4. Доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК припреобладании определенной формы головок сперматозоидовДоля сперматозоидов с фрагментированнойФорма головкиДНК (%)Аморфная0,62±0,07Грушевидная0,65±0,13Вакуолизированная1,02±0,17С патологией акросомы0,46±0,12Рисунок 7. Эмпирические данные илиния регрессии долисперматозоидов свакуолизированной формой головкипо доле сперматозоидов сфрагментированной ДНКВ настоящей работы также проведен анализ фрагментации ДНКиндивидуальных эякулированных сперматозоидов (Рис. 8).
С помощьюмикроманипулятора были отобраны 89 сперматозоидов с нормальнойформой головки и 196 - с вакуолизированной. Флуоресцентный сигнал,свидетельствующий о фрагментации ДНК, в сперматозоидах с нормальнойголовкой обнаружен лишь в одном случае из 89 (1,12%) и в 28 из 196(14,29%) сперматозоидов с вакуолизированной головкой. Таким образом,доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК среди форм свакуолизированной головкой оказалась достоверно выше (точный тестФишера, p=0,0008).Рисунок 8. Флуоресцентное мечениеразрывов ДНК сперматозоидов методомTUNEL.Сперматозоидысфрагментированной (флуоресцируют взеленом спектре) и интактной ДНК(флуоресцируют в синем спектре) (ув.10х100х0,5)Таким образом, вакуолизированная форма головки сперматозоидаявляется морфологическим маркером фрагментации ДНК. Поиск маркеровфрагментации ДНК сперматозоидов особенно актуален в связи с бурным15развитием вспомогательных репродуктивных технологий.
Несомненно, привыборе сперматозоида для оплодотворения предпочтение отдаетсяморфологически нормальным, однако в случае тератозооспермии, когда вэякуляте присутствуют только аномальные сперматозоиды, вопрос выборастоит особенно остро.В настоящей работе была проанализирована взаимосвязь между долейсперматозоидов с фрагментированной ДНК и долей сперматозоидов,содержащих 5-гидроксиметилцитозин. Основанием для анализа этойвзаимосвязи было предположение о влиянии АФК как на возникновениеразрывов ДНК, так и на активацию процесса активного деметилированияДНК с образованием 5-гидроксиметилцитозина.Для достижения этой цели была проанализирована долясперматозоидов,содержащих5-гидроксиметилцитозин,идолясперматозоидов с фрагментированной ДНК в эякуляте доноров спермы(контрольная группа) и в эякуляте пациентов с нарушением фертильности.Доля сперматозоидов, содержащих 5-hMeС, как в контрольной группедоноров спермы, так и у пациентов с нарушением фертильности, варьировала(от 0,06% до 4,03% у доноров спермы, от 0,3% до 13,89% у пациентов снарушением фертильности) (Рис.
9).Рисунок 9. Сперматозоиды из эякулята после окрашивания DAPI (А), спомощью антител к 5-MeC (Б) и 5-hMeC (В) (ув. 10х100)По результатам корреляционного анализа была выявлена прямаяположительная корреляция между долей сперматозоидов, содержащих 5гидроксиметилцитозин, и долей сперматозоидов с фрагментированной ДНК(коэффициент корреляции Спирмена r=0,52, p=0,0152) (Рис.
10).Рисунок 10. Эмпирические данные илиниярегрессиидолисперматозоидов, содержащих 5hMeC, по доле сперматозоидов сфрагментированной ДНК16Таким образом, высокая доля сперматозоидов с фрагментированнойДНКсочетаетсясвысокойдолейсперматозоидовс5гидроксиметилированной ДНК.3. Влияние фрагментации ДНК сперматозоидов на эффективностьоплодотворения и морфологические характеристики эмбрионов,культивируемых in vitroВопрос о влиянии фрагментации ДНК сперматозоида наоплодотворение ооцита, ключевые этапы доимплантационного развития,имплантацию и исход программ экстракорпорального оплодотворенияостается открытым.
Действие АФК является основной причиной нарушенияцелостности ДНК сперматозоида (Shamsi et al., 2008). Помимо ДНКсперматозоида, мишенью АФК также являются липиды плазматическоймембраны. Перекисное окисление липидов приводит к нарушениюплазматической мембраны, препятствует акросомной реакции и слияниюплазматических мембран сперматозоида и ооцита при оплодотворении.Нарушение цитоплазматической мембраны сперматозоидов может являтьсяпричиной снижения их подвижности и, как следствие, эффективностиоплодотворения.
Можно предположить, что при оплодотворении методомЭКО, максимально приближенному к условиям оплодотворения in vivo,эффективность должна быть ниже, поскольку сперматозоиды сфрагментированной ДНК, при условии, что фрагментация обусловленадействием АФК, должны двигаться медленнее вследствие перекисногоокисления липидов плазматической мембраны. Вместе с тем приоплодотворении методом ICSI, или внутрицитоплазматической инъекциисперматозоида, эффективность должна быть выше.Для оценки влияния фрагментации ДНК сперматозоидов наоплодотворение и морфологические характеристики эмбрионов былипроанализированы данные 54 эмбриологических протоколов, в 20 из которыхоплодотворение ооцитов проводили методом ЭКО, в 34 – методомвнутрицитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (метод ICSI).Эффективность оплодотворения рассчитывали как отношение числадвупронуклеарных зигот к числу полученных ооцит-кумулюсныхкомплексов.
Эффективность оплодотворения оценивали в группах ЭКО иICSI,отличающихсяметодомоплодотворенияисодержаниемсперматозоидов с фрагментированной ДНК: менее 0,35% и более 0,35%(пороговое значение доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК удоноров спермы) (Табл. 5).17Таблица 5. Доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК иэффективность оплодотворения в группах ЭКО и ICSIЧислоДоля сперматозоидовМетодЭффективностьпротоколовс фрагментированнойоплодотворения (%)(n)ДНК (%)110,07±0,02*64,15±7,59ЭКО91,24±0,29*54,51±13,23170,1±0,03**65,23±5,67ICSI171,08±0,15**62,71±6,22*,** достоверно значимые отличия, критерий Краскела-Уоллиса, p≤0,0001Внастоящемисследованииприсравненииэффективностиоплодотворения в зависимости от доли сперматозоидов с фрагментированнойДНК, как при оплодотворении методом ЭКО, так и при оплодотворенииметодом ICSI, достоверных отличий обнаружено не было (р=0,3977,ANOVA).В то же время между показателями доли сперматозоидов сфрагментированной ДНК и долей морфологически нормальных эмбрионов,которую рассчитывали как отношение числа эмбрионов на стадии морулы на4 сутки развития (Grade 4, Tao et al., 2002) к числу двупронуклеарных зигот,была выявлена отрицательная взаимосвязь (коэффициент корреляцииСпирмена r= - 0,51, p=0,0001) (Рис.
11). Вероятно, часть разрывов ДНКсперматозоида может быть репарирована ферментами ооцита вскоре послеоплодотворения до стадии 4-8 клеток, когда происходит зиготическаятрансформация (MZT, maternal to zygotic transformation) (Braude et al., 1988;Ménézo et al., 2010). В то время как нерепарированные разрывы ДНКсперматозоида могут привести к нарушению работы генома эмбриона иостановке развития на ранних этапах эмбриогенеза.Рисунок11.Эмпирическиеданные и линия регрессии долиэмбрионов высшего качества подолесперматозоидовсфрагментированной ДНК18Таким образом, было показано, что увеличение доли сперматозоидов сфрагментированной ДНК не снижает эффективности оплодотворения, ноприводит к нарушению развития эмбрионов при культивировании in vitro.ЗАКЛЮЧЕНИЕВ настоящем исследовании установлено, что около 11% мужчин снарушением фертильности являются носителями числовых и структурныханомалий кариотипа.
При этом, для таких пациентов характерноварьирование как уровня фрагментации ДНК сперматозоидов, так ипараметров спермиологического анализа, от нормальных до патологичных.Таким образом, показано, что аномалии кариотипа, как числовые, так иструктурные, не всегда сопровождаются нарушением сперматогенеза. В тожевремя для пациентов со структурными аномалиями отмечено увеличениедоли морфологически аномальных эмбрионов и эмбрионов с хромосомнымдисбалансом.В настоящем исследовании было показано, что нарушениефертильности в 70% случаев сопровождается снижением показателейспермиологического анализа, проведенного в соответствии с нормативамиВОЗ 2010 года, и в 95% - в соответствии с нормативами ВОЗ 1999 года.