Автореферат (Генетические и эпигенетические особенности генома сперматозоида и их влияние на ранее эмбриональное развитие человека), страница 2

Диссертация изложена на 144страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы,материал и методы, результаты, обсуждение, выводы, список литературы(274 источника), приложение (содержит 10 таблиц). Работа содержит 15таблиц и 16 рисунков.МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫМатериалом для исследования служили образцы периферическойкрови 204 пациентов и 12 доноров спермы, направленных накариотипирование, образцы эякулята 274 пациентов и 12 доноров спермыотделения ВРТ НИИ АГиР им.

Д. О. Отта.Лимфоциты периферической крови культивировали по стандартнойметодике с модификациями (Кузнецова и др., 1999). Идентификацию QFHокрашенных метафазных хромосом проводили руководствуясь стандартамимеждународной цитогенетической номенклатуры хромосом человека (ISCN,2009).

Гибридизацию с зондами проводили в соответствии с рекомендациямифирмы-производителязондов(Vysis,AbbottMolecular,США).Спермиологический анализ проводили согласно рекомендациям ВОЗ (WHO,1999). Препараты из эякулята готовили по методике Кузнецовой ссоавторами (Кузнецова и др., 1990). Флуоресцентное мечение одно- идвунитевых разрывов ДНК сперматозоидов проводили методом TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP Nick-End Labelling)(Negoescu et al., 1996). Детекцию 5-метилцитозина (5-МеС) и 5гидроксиметилцитозина (5-hMeC) на препаратах проводили с помощьюспецифических антител (Efimova et al., 2015).Анализ препаратов проводили с помощью микроскопов: ЕС ЛЮМАМРПО11 (ЛОМО) с объективами СХ 20х/0,45 и М-флюар 100х/1,30 с тубуснойоптикой с линзами от 1,1х до 1,6х, черно-белой CCD камерой накоплениясигнала (Chiper); Zeiss Axiostar Plus, оборудованного объективами Zeiss Aplan 10х,0,25 и 100х/1,25 oil; LEICA DM LS, оборудованного объективамиFLUOTAR 20x/0,40 и 100x/1,30-0,060, автоматической фотонасадкой,7цветной камерой Leica DFC Twain.

Для получения фотоизображенияиспользовали программное обеспечение Leica DFC Twain. Для анализавидеоизображения использовали программное обеспечение Adobe PhotoshopCS5. Отбор индивидуальных сперматозоидов проводили с помощьюмикроскопа LEICA DMI 3000B, оборудованного объективами 5х, 10х,20х/0,4, 40х/0,60, L63x и микроманипулятором Narishige IM-6.Данные эмбриологических протоколов, а также результатыпредимплантационной генетической диагностики любезно предоставленысотрудниками ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.

О. Отта».Статистический анализ данных проводили на ПК с помощью программStatGraphics и GraphPadSoftware.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ1. Частота и спектр аномалий кариотипа у пациентов с нарушениемфертильностиВ результате анализа кариотипа 204 пациентов, обратившихся вотделение вспомогательных репродуктивных технологий НИИ АГиР им. Д.О. Отта в связи с бесплодием, у 22 выявлены числовые и структурныеаномалии (Рис. 1 и 2).Рисунок 1. Частота и спектр аномалий кариотипа у мужчин снарушением фертильностиАномалии кариотипа выявляют в 2 – 19% случаев нарушенияфертильности, при этом числовые аномалии встречаются чаще, чемструктурные (Shi and Martin, 2001; Ferlin et al., 2006, Martin, 2008; Huleyuk etal., 2010). В нашем исследовании структурные аномалии, напротив,встречались чаще, чем числовые (n=15 и n=7, соответственно), что, скореевсего, связано с особенностями выборки: носители структурных аномалий, вотличие от носителей числовых, не имеют выраженных фенотипическихособенностей и направляются на кариотипирование только привозникновении репродуктивных проблем.8В отдельных случаях, для уточнения результатов кариотипирования илокализации точек разрыва, был проведен ряд дополнительных исследованийс использованием флуоресцентной гибридизации in situ.Рисунок 2.

Метафазные хромосомы излимфоцита периферической крови пациента скариотипом46,XY,inv(4)(p12;q21),inv(10)(p11;q21) послеQFH/AcDокрашивания(ув.10х100)Таким образом, у мужчин с нарушением фертильности частотааномалий кариотипа составила 10,78% с преобладанием структурныхперестроек хромосом.Вопрос о частоте образования эмбрионов с хромосомным дисбалансомв супружеской паре, в которой мужчина является носителем структурныхили числовых аномалий кариотипа, остается открытым. В рамках настоящегоисследования были проанализированы результаты 8 эмбриологическихпротоколовспредимплантационнойгенетическойдиагностикой,проведенной в НИИ АГиР им.

Д. О. Отта. Критериями включения висследование являлись следующие параметры: нормальный кариотипсупруги и ее возраст менее 35 лет, и известный кариотип супруга. В группепациентов со структурными аномалиями кариотипа отмечено увеличениедоли эмбрионов с хромосомных дисбалансом и снижение долиморфологически нормальных эмбрионов на 4 - 5 сутки развития in vitro, что,наиболее вероятно, связано с аномальным кариотипом эмбриона (Рис.

3 и 4).9Рисунок 3. Соотношение эмбрионов со сбалансированным кариотипом ихромосомным дисбалансом в группах пациентов со структурнымианомалиями хромосом и нормальным кариотипомРисунок 4. Доли морфологическинормальных эмбрионов в группахпациентовсоструктурнымианомалиямихромосоминормальнымкариотипом2. Фрагментация ДНК сперматозоидов пациентов с нарушениемфертильностиПомимо наследственных, к нарушению сперматогенеза приводитвлияние негативных факторов внешней среды: инфекционных агентов,физических и химических факторов, токсинов, которые могут вызыватьокислительный стресс.

В результате этого процесса нарушаетсяокислительно-восстановительный статус клетки, происходит образованиеАФК, мишенью которых являются липиды и нуклеиновые кислоты.Показано, что действие АФК является основной причиной повреждения ДНКсперматозоидов (Shamsi et al., 2008). В свою очередь, с нарушениемцелостности ДНК сперматозоидов связано до 20% случаев идиопатического,то есть без видимой причины, мужского бесплодия (SCASA, 2005).

Внастоящем исследовании с помощью метода флуоресцентного мечения однои двунитевых разрывов ДНК - TUNEL - была проведена оценка долисперматозоидов с фрагментированной ДНК в эякуляте пациентов с10нарушением фертильности с учетом результатов спермиологическогоанализа.Показано,чтонаименьшаядолясперматозоидовсфрагментированной ДНК характерна как для доноров спермы, так и дляпациентов с нормозооспермией, а наибольшая - для пациентов стератозооспермией (достоверно значимые отличия, критерий КраскелаУоллиса, p≤0,05) (Табл. 1).Таблица 1. Доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК у пациентов снарушением фертильностиЧислоДоля сперматозоидов сРезультат спермограммыпациентовфрагментированной(нормативы ВОЗ, 1999 г.)(n)ДНК (%)Нормозооспермия90,39±0,12Тератозооспермия530,79±0,08Олигоастенотератозооспермия110,51±0,16Астенотератозооспермия130,50±0,11Астенозооспермия21,04±0,28Олигоастенозооспермия10,1Олиготератозооспермия20Доноры спермы (контрольная группа)120,19±0,03Примечание: тератозооспермия – снижение доли морфологическинормальных сперматозоидов, олигоастенотератозооспермия – снижениеконцентрации, подвижности и доли морфологически нормальныхсперматозоидов, астенотератозооспермия – снижение подвижности и долиморфологически нормальных сперматозоидов, астенозооспермия – снижениеподвижности, олигоастенозооспермия – снижение концентрации иподвижности, олиготератозооспермия – снижение концентрации и долиморфологически нормальных сперматозоидовСпермиологический анализ, проводимый в соответствии снормативами ВОЗ, является основным методом оценки сперматогенеза.

Вруководстве ВОЗ 1999 года за норму были приняты следующие показателиспермиологического анализа: концентрация сперматозоидов более 20млн/мл, подвижность – категории А более 25% (прогрессивно-подвижныесперматозоиды, двигающиеся со скоростью более 25 мкм/с при 37°С), илисуммарно категории А и В более 50% (прогрессивно-подвижныесперматозоиды и медленные прогрессивно-подвижные сперматозоиды), доляморфологически нормальных сперматозоидов более 14% от их общего числав эякуляте (WHO, 1999). В руководстве ВОЗ 2010 года пороговые значенияосновных параметров спермиологического анализа были снижены. Так,концентрация сперматозоидов - с 20 млн/мл до 15 млн/мл, доляморфологически нормальных сперматозоидов - с 14% до 4% (WHO, 2010). Внастоящей работе группы сравнения сформированы согласно нормативамВОЗ 1999 года, поскольку исследование начато в 2008 году.

Интересноотметить, что при использовании новых нормативов ВОЗ 2010 года в 35,1%11случаев одинаковые результаты спермограмм были интерпретированы поразному (Табл. 2).Таблица 2. Результаты спермограмм пациентов с нарушением фертильностисогласно нормативам ВОЗ 1999 и 2010 годовНормативыНормативыВОЗ 1999 г.ВОЗ 2010 г.Результат спермограммыn%n%азооспермия83,1983,19олигоастенотератозооспермия4819,123011,95олигоастенозооспермия10,441,59олиготератозооспермия51,99103,98олигозооспермия0041,59астенозооспермия31,293,59тератозооспермия12549,88333,07астенотератозооспермия4819,123614,34нормозооспермия135,186726,7ИТОГО (Σ)251100251100Примечание: азооспермия – отсутствие сперматозоидов в эякуляте,олигозооспермия – снижение концентрации сперматозоидовТаким образом, нарушение фертильности у мужчин в 70% случаевсопровождалось снижением показателей спермиологического анализа,проведенного в соответствии с нормативами ВОЗ 2010 года, и в 95% случаев– в соответствии с нормативами ВОЗ 1999 года.Изучение сперматогенеза у пациентов с аномалиями кариотипапредставляет особый интерес.

В настоящем исследовании для носителейчисловых и структурных нарушений кариотипа отмечено варьирование всехпоказателей спермиологического анализа, от нормальных до патологичных.Таким образом, аномалии кариотипа не во всех случаях сопровождаютсяснижением концентрации сперматозоидов, что вероятно, может бытьобусловлено, в том числе, и абортивным апоптозом, при котором половыеклетки, в которых процесс программируемой клеточной гибели был запущен,но не до конца завершен, попадают в эякулят. В данной работе для носителейчисловых и структурных аномалий кариотипа была проанализирована долясперматозоидов с фрагментированной ДНК, которая, как было показано,варьировала значительно, вне зависимости от типа аномалии (Табл. 3).12Таблица 3.

Доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК у пациентов саномалиями кариотипаДоля сперматозоидов сКариотипфрагментированной ДНК (%)47,XYY0,246,XY/47,XXY0,3846,XY,add(22)(p11)0,0546,XY,inv(7)(p22;q11.2)2,2745,XY,der(13;14)(q10;q10)1,0745,XY,der(13;14)(q10;q10)0,6845,XY,der(14;21)(q10;q10)0,3446,XY,t(1;5)(p22;q32),t(6;12)(q15;q21)0,4546,XY,t(1;7)(q42;p22)0,0946,XY,t(6;19)(p22;q12)0,45В настоящем исследовании проведена оценка морфологии головокэякулированных сперматозоидов. Согласно «строгому критерию Крюгера»выделяют следующие формы головок: нормальная, с небольшой патологией,маленькая, большая, удлиненная, грушевидная, вакуолизированная,аморфная, двойная, точечная, округлая, с патологией акросомы (Kruger et al.,1986) (Рис. 5).нормальнаяс небольшойпатологиеймаленькаябольшаяудлиненнаягрушевиднаявакуолизированнаяаморфнаяпатологияакросомыРисунок 5.