Автореферат (Генетические и эпигенетические особенности генома сперматозоида и их влияние на ранее эмбриональное развитие человека)

На правах рукописиШильникова Евгения МихайловнаГЕНЕТИЧЕСКИЕ И ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ГЕНОМАСПЕРМАТОЗОИДА И ИХ ВЛИЯНИЕ НА РАННЕЕ ЭМБРИОНАЛЬНОЕРАЗВИТИЕ ЧЕЛОВЕКАспециальность 03.02.07 – генетикаАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата биологических наукСанкт-Петербург20152Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательномучреждениивысшегопрофессиональногообразования«Санкт-Петербургскийгосударственный университет» и в Федеральном государственном бюджетном научномучреждении «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии ирепродуктологии имени Д.

О. Отта».Научный руководитель:Член-корр. РАН, з.д.н., д.м.н., профессорВладислав Сергеевич Баранов, заведующийлабораторией пренатальной диагностикинаследственных и врожденных заболеванийчеловека ФГБНУ «НИИ АГиР им.Д.О. Отта»Официальные оппоненты:Доктор биологических наук, профессорЕвгений Львович Паткин, заведующийлабораторией молекулярной цитогенетикиразвитиямлекопитающихФГБНУ«Институт экспериментальной медицины»(г.Санкт-Петербург)Кандидат медицинских наук ВячеславБорисович Черных, старший научныйсотрудник лаборатории генетики нарушенийрепродукции ФГБНУ «Медико-генетическийнаучныйцентр»(г.Москва)Ведущее учреждение: ФГБНУ «Научно-исследовательский институт медицинскойгенетики», г. ТомскЗащита диссертации состоится «» ____________ 2015 г.

вчасов на заседаниисовета Д 212.232.12. по защите докторских и кандидатских диссертаций при СанктПетербургском Государственном университете по адресу: 199034, г. Санкт-Петербург,Университетская наб., д. 7/9, СПбГУ, биологический факультет, кафедра генетики ибиотехнологии, аудитория 1.С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке им. М. Горького СанктПетербургского Государственного университета и на сайте Санкт-Петербургскогогосударственного университета (http://spbu.ru/).Автореферат разослан «» _______________ 2015 г.Ученый секретарьДиссертационного совета Д 212.232.12доктор биологических наукЛюдмила Андреевна Мамон3ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность темы исследования и степень разработанностипроблемыСперматогенез человека – сложный многоэтапный процесс, врезультате которого путем последовательных делений и преобразований издиплоидных клеток формируются высокоспециализированные гаплоидныеполовые клетки – сперматозоиды, основной функцией которых являетсяхранение и транспортировка наследственной информации.

К изменениюморфо-функциональных характеристик сперматозоидов и структурнофункционального состояния их генома могут приводить возникающие налюбомизэтаповсперматогенезанарушения,вызванныекакнаследственными, так и экзогенными факторами.Среди наследственных факторов выделяют нарушения кариотипа, втом числе числовые и структурные аномалии. Хромосомные перестройкинарушают процесс нормальной конъюгации и синапсиса хромосом, чтоприводит к блоку сперматогенеза, и, соответственно, снижениюспермопродукции. В то же время у носителей структурных аномалийкариотипа повышена частота образования несбалансированных гамет,которые могут принять участие в оплодотворении, увеличивая вероятностьпоявления эмбрионов с хромосомным дисбалансом. Другой причинойснижения фертильности у мужчин являются микроделеции хромосомы Y влокусе AZF. Продукты более 2000 генов обеспечивают дифференцировку исозревание мужских половых клеток.

Установлено, что от 10% до 50%случаев нарушения сперматогенеза вызвано изменениями кариотипапациента и/или мутациями отдельных генов (Ferlin, 2012).Немаловажную роль в нарушении сперматогенеза играютнеблагоприятные факторы внешней среды, курение, ожирение, стресс,которые приводят к образованию активных форм кислорода (АФК) в клетке.Последние, в свою очередь, напрямую связаны с процессом активногодеметилирования ДНК, являющегося одним из основных эпигенетическихмеханизмов регуляции функции генов. В процессе активногодеметилирования происходит превращение 5-метилцитозина в цитозин.

Приэтом в ходе последовательных биохимических реакцийобразуютсякислородсодержащие производные 5-метилцитозина, в том числе 5гидроксиметилциозин. Для изучения гидроксиметилирования ДНКразработанрядподходов,однимизкоторыхявляетсяиммуноцитохимическая детекция 5-гидроксиметилцитозина с помощьювысокоспецифичных антител. Использование иммуноцитохимическогоподхода для оценки эпигенетического статуса генома особенноцелесообразно при работе с отдельными клетками, в том числе половыми.Другой мишенью АФК является ДНК половых клеток. Действительно,20% случаев идиопатического бесплодия обусловлено нарушениемцелостности ДНК сперматозоидов (SCSA, 2005). Одним из основныхметодов оценки фрагментации ДНК сперматозоидов является метод4флуоресцентного мечения одно- и двунитевых разрывов ДНК (TUNEL Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP Nick-End Labelling).Фрагментация ДНК сперматозоида влияет на первые деления дроблениязародыша, частоту имплантации и наступления беременности (Shamsi et al.,2008).

Вероятно, нарушение целостности ДНК сперматозоида можетприводить к изменению его морфологии. В связи с этим, изучениевзаимосвязи между морфологическими характеристиками сперматозоидов иструктурно-функциональными и эпигенетическими особенностями их геномаявляется актуальным. Выявление такой взаимосвязи важно длянаправленного отбора сперматозоидов в условиях искусственногооплодотворения и реализации программ вспомогательных репродуктивныхтехнологий.

Тем более что нарушение сперматогенеза - одна из основныхпричин бесплодия, частота которого во многих странах, в том числе и вРоссии, достигает 15% (WHO, 2010). При этом вклад мужского фактора вэтиологию бесплодия составляет 50-60% (WHO, 2010), и в последниедесятилетия отмечается снижение основных показателей спермограммы –концентрации, подвижности и морфологии сперматозоидов (Slama et al.,2002; Cooper et al., 2010; Jorgensen et al., 2011; Rolland et al., 2013).В связи с этим цель настоящего исследования – оценить взаимосвязьмеждуморфо-функциональнымихарактеристикамисперматозоидов,целостностью их ДНК и уровнем ее гидроксиметилирования, а такжеэффективностью оплодотворения, способностью к развитию эмбрионов,полученных от пациентов с нормальным и аберрантным кариотипами.В рамках этой цели были сформулированы следующие задачи:1.

Провести анализ кариотипа пациентов с нарушением фертильности.2. ПровестисравнительныйанализуровняфрагментацииДНКсперматозоидов у пациентов с различными нарушениями параметровспермограммы.3. Проанализировать взаимосвязь между степенью фрагментации ДНКсперматозоидов и преобладанием различных форм аномалий их головок.4. Проанализировать долю сперматозоидов с фрагментированной ДНК упациентов с нарушениями конституционального кариотипа.5. СопоставитьуровеньфрагментацииДНКсуровнемгидроксиметилирования генома сперматозоидов у пациентов снарушением фертильности.6.

Оценить влияние нарушения целостности ДНК сперматозоидов наэффективность оплодотворения и развитие эмбрионов, полученных спомощью вспомогательных репродуктивных технологий.Научная новизна. Впервые установлено, что для носителей числовых иструктурных нарушений кариотипа характерно варьирование как уровняфрагментации ДНК сперматозоидов, так и параметров спермиологическогоанализа. Уверенно доказано, что увеличение доли сперматозоидов сфрагментированной ДНК характерно для пациентов со сниженнымсодержанием морфологически нормальных сперматозоидов. Кроме того,выявлен морфологический маркер нарушения целостности ДНК5сперматозоидов – вакуолизированная головка. Впервые показано, чтовысокий уровень фрагментации ДНК соответствует высокому уровнюсодержания гидроксиметилированных сперматозоидов в эякуляте.

Доказано,что нарушение целостности ДНК сперматозоидов не снижает эффективностиоплодотворения, но приводит к нарушению развития эмбрионов прикультивировании in vitro.Теоретическаяипрактическаязначимость.Настоящееисследование выполнено в рамках изучения взаимоотношения генотип фенотип при формировании сложных признаков. Результаты настоящегоисследования вносят существенный вклад в понимание взаимосвязи междуморфологическими характеристиками сперматозоидов и структурнофункциональными и эпигенетическими особенностями их генома.Понимание этой взаимосвязи позволит осуществлять направленнуюселекцию сперматозоидов, используемых для оплодотворения с цельюповышения его эффективности и вероятности развития нормальныхэмбрионов.Результатыпроведенногоисследованиямогутбытьиспользованы для разработки алгоритмаобследования пациентов снарушением фертильности, что особенно актуально для пар, прошедших ряднеудачных попыток ЭКО.Положения, выносимые на защиту:1.

Частота аномалий кариотипа у пациентов с нарушением фертильности,нуждающихся в применении вспомогательных репродуктивныхтехнологий, составляет 10,78%.2. Нарушение фертильности у мужчин в 70% случаев обусловленоснижением показателей спермиологического анализа, проведенного всоответствии с нормативами ВОЗ 2010 года, и в 95% случаев – всоответствии с нормативами ВОЗ 1999 года.3.

Увеличение доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК характернодля пациентов со сниженным содержанием морфологически нормальныхсперматозоидов в эякуляте.4. Вакуолизированнаяформаголовкисперматозоидаявляетсяморфологическим маркером нарушения целостности его ДНК.5. Для носителей числовых и структурных нарушений кариотипа характеренширокий диапазон варьирования как параметров спермиологическогоанализа, так и уровня фрагментации ДНК сперматозоидов в эякуляте.6. Для пациентов, в эякуляте которых повышено содержаниесперматозоидов с фрагментированной ДНК, характерен высокий уровеньсодержания 5-гидроксиметилированных сперматозоидов.Апробация работы.

Результаты работы опубликованы в виде пяти статей(три из них - в отечественных изданиях, рекомендованных ВАК, две – вмеждународныхнаучныхрецензируемыхжурналах).Материалыдиссертации были представлены на различных международныхконференциях и семинарах, в том числе 5-ом конгрессе по репродуктивноймедицине WARM (Москва, Россия, 2010 г.), 8-ой конференции поцитогенетике человека ECA (Порто, Португалия, 2011 г.), 10-ой конференции6средиземноморского общества репродуктивной медицины MSRM (Будва,Черногория, 2012 г.), 3-ей конференции молодых ученых и специалистов«Репродуктивная медицина: взгляд молодых» (Санкт-Петербург, Россия,2012 г.), 46-ой конференции по генетике человека ESHG (Нюрнберг,Германия, 2012 г.), 22-ой конференции репродуктивной ассоциациирепродукции человека (Геленджик, Россия, 2012 г.), первый национальныйфорум «Репродуктивное здоровье как фактор демографическойстабилизации» (Ростов-на-Дону, Россия, 2012 г.), 47-ой конференции погенетике человека ESHG (Париж, Франция, 2013 г.), первом российскоазиатском уро-андрологическом конгрессе (Санкт-Петербург, Франция, 2014г.), 17-ой Всероссийской медико-биологической конференции молодыхисследователей (Санкт-Петербург, Россия, 2014 г.), 48-ой конференции погенетике человека ESHG (Милан, Италия, 2014 г.).Объем и структура диссертации.