Автореферат (Фенотипическое проявление повреждений генетического материала, учитываемых в альфа-тесте у дрожжей Saccharomyces cerevisiae), страница 4

Это возможноблагодаря тому, что дрожжевые клетки могут вступать в гибридизацию только настадии G1, поэтому появление "незаконного" гибрида или цитодуктанта отражаетне только факт повреждения локуса MATα, но также показывает, что оно13проявилось в виде переключения типа спаривания на стадии G1, независимо оттого, на какой стадии клеточного цикла возникло первичное повреждение.Для того чтобы изучить возможность сохранения в ДНК первичныхповреждений на протяжении нескольких стадий клеточного цикла, мы определилизначение частоты наследуемых и ненаследуемых генетических изменений,индуцированных ультрафиолетовым (УФ) излучением в клеточных культурах,заблокированных на стадии G1 клеточного цикла, а также в асинхронныхкультурах клеток дрожжей.

Для синхронизации культур штаммов дрожжей,применяемых в альфа-тесте, мы использовали температурно-чувствительнуюмутацию cdc28-4. Мутация cdc28-4 нарушает активность циклин-зависимойпротеинкиназы Cdc28 при температуре 37оС, что препятствует переходу клетокдрожжей из стадии G1 в стадию S и приводит к остановке клеточного цикла настадии G1 (Reed, 1980).Альфа-тест с культурами, синхронизированными на стадии G1, проводилиследующим образом. Клетки штамма К5-35В-Д924 дикого типа (wt) и изогенногомутантного штамма cdc28-4, высевали на чашки с полной твердой средой иинкубировали 2 часа при температуре 37оС. За это время абсолютное большинствоклеток мутантного штамма cdc28-4, но не штамма wt, переходит в стадию G1клеточного цикла.

Для индукции повреждений ДНК дрожжевые клетки облучалиУФ светом, после чего к ним дополнительно подсевали клетки штамма Д-926,являющегося партнером для скрещивания. В случае отрицательного контроляпроцедуру проводили тем же способом за единственным исключением: клетки необлучали УФ светом. Чашки инкубировали двое суток. Часть чашек помещали втермостат с температурой 22оС, таким образом клетки штамма cdc28-4 выходилииз блока на стадии G1 и могли продвигаться дальше по клеточному циклу.

Другуючасть чашек инкубировали при 37оС, и в этом случае блок клеточного цикла настадии G1 у мутанта cdc28-4 сохранялся на протяжении всего времениинкубирования при 37°С или до момента образования "незаконного" гибрида.Наши результаты показали, что у штамма cdc28-4 при сохранениипостоянного блока клеточного цикла на стадии G1 частота "незаконной"гибридизации под действием УФ излучения возрастала в 16 раз, при этом особенносильно увеличивалась частота класса "мутации и временные повреждения" (в 49раз), по сравнению со спонтанным уровнем при той же температуре (рисунок 5).Анализ распределения долей классов показывает, что в том случае, когда клеткибыли заблокированы на стадии G1 постоянно, доля класса "мутации и временныеповреждения" возрастала до 89%, а доля "незаконных" гибридов, потерявшиххромосому III или ее правое плечо, уменьшалась.

В том случае, когда блокклеточного цикла на стадии G1 снимали после генотоксического воздействия, УФизлучение индуцировало "незаконную" гибридизацию в 3 раза по сравнению соспонтанным уровнем в тех же условиях (рисунок 5), а распределение классовгенетических событий не отличается от распределения соответствующих классов,полученных спонтанно у мутанта cdc28-4 и wt при температуре 22оС.Мы предполагаем, что возрастание частоты класса "мутации и временныеповреждения" при сохранении постоянного блока клеток на стадии G1 происходитза счет временных повреждений в локусе MATα, т.е. за счет тех первичныхповреждений, которые проявляются фенотипически еще до их устранениясистемами репарации.

Для проверки этой гипотезы мы провели тест на14"незаконную" цитодукцию на культурах клеток дрожжей, заблокированных настадии G1.Рисунок 5. Отношение общей частоты "незаконной" гибридизации, а такжечастоты каждого из учитываемых генетических событий в дрожжевых культурах,обработанных УФ излучением, к частоте тех же событий, возникших спонтанно, вкультурах штаммов дикого типа (wt) и cdc28-4 при температуре 22°С или 37°С. Fчастота генетических событий, учитываемых в тесте на "незаконную"гибридизацию. * – значения при воздействии УФ излучением достоверноотличаются по критерию Вилкоксона (Р<0,05) от значения частоты без обработкиУФ излучением при тех же температурах.Мы показали, что в тесте на "незаконную" цитодукцию у штаммов wt иcdc28-4 возрастание частоты временных повреждений под действием УФизлучения наблюдалось как при температуре 22оС, так и при 37оС по сравнению соспонтанным уровнем при тех же значениях температуры (рисунок 6 А. Б).

Длятого, чтобы выявить возможные различия между действием УФ излучения наасинхронные и заблокированные на стадии G1 клеточные культуры мы определилииндуцированную УФ излучением частоту класса "временные повреждения" уштаммов wt и cdc28-4 при температуре 22°С и 37°С (рисунок 6 А. Б).

Полученныерезультаты указывают на то, что при 37°С, когда у штамма cdc28-4, но не wt,наступает блок клеточных делений на стадии G1, индуцированная частота класса"временные повреждения" у мутанта cdc28-4 в 6 раз превышает индуцированнуючастоту тех же событий у wt (рисунок 6 Б). Другая картина наблюдается при 22°С,когда блока клеточных делений не наступает, и клетки обоих штаммовпродолжают движение по клеточному циклу: индуцированная частота класса"временные повреждения" у штамма cdc28-4 в 3 раза выше, чем у штамма wt(рисунок 6 А).Данные, полученные с использованием культур, заблокированных на стадииG1, показывают, что первичные повреждения, индуцированные УФ излучением ивозникшие на стадии G1, проявляются фенотипически на той же стадии, еще до ихустранения системами репарации и превращения первичных повреждений внаследуемые изменения генетического материала.15Рисунок 6.

Индуцированная УФ излучением частота временных повреждений влокусе MATα у штамма дикого типа (wt) и мутанта cdc28-4 при температуре (А)22оС и (Б) 37оС. Индуцированная частота – это разность частоты при воздействииУФ излучением и частоты без воздействия. F-частота генетических событий,учитываемых в тесте на "незаконную" цитодукцию. * – значения при воздействииУФ излучением достоверно отличаются по критерию Вилкоксона (Р<0,05) отзначения частоты без обработки УФ излучением при тех же температурах.Таким образом, совокупность данных, полученных в нашей работе, позволятпредложить следующий механизм фенотипического проявления первичныхповреждений в связи со стадиями клеточного цикла в альфа-тесте.

Если первичноеповреждение возникло на стадии G1 и привело к временному переключению типаспаривания, то клетка может вступать в скрещивание с образованием"незаконного" гибрида или цитодуктанта. Устранение этого первичногоповреждения произойдет после скрещивания дрожжевых клеток. В этом случаеименно первичное повреждение стало тем событием, которое привело кпереключению типа спаривания, а альфа-тест позволил зафиксировать егофенотипическое проявление. Если первичное повреждение возникло на другихстадиях клеточного цикла S, G2 или M, то оно может быть устранено системамирепарации еще до скрещивания дрожжевых клеток.

К следующей стадии G1, гдевозможно скрещивание дрожжевых клеток, первичное повреждение ужепревратится в наследуемое изменение генетического материала, которое и будетпричиной переключения типа спаривания клетки α → а. В этом случаесамостоятельное фенотипическое проявление первичного повреждения в альфатесте увидеть невозможно. Тем не менее, частота "незаконной" гибридизации илицитодукции отражает общую частоту индуцируемых изучаемым мутагеннымфактором первичных повреждений, часть из которых мы фиксируем на уровнепервичных повреждений, а часть на уровне наследуемых изменений, которыевозникли в ходе нетождественной репарации ДНК с первичным повреждением.Чем больше клеточных циклов будет проходить клетка от момента возникновенияпервичного повреждения до скрещивания, тем больше вероятность того, что вальфа-тесте будет зафиксировано проявление наследуемого изменения, а непервичного повреждения.

Таким образом, если первичное повреждение возниклона стадиях S, G2, или M, возможность его фенотипического проявления во многомзависит от молекулярной природы повреждения и его способности блокировать16репликацию. Например, модификации оснований, индуцированные аналогамиоснований, не блокируют репликацию (Shcherbakova et al., 1996; Haracska et al.,2000; Boiteux et al., 2002; de Padula et al., 2004; Lada et al., 2013), поэтому, даже еслиони возникли на стадиях S, G2 или M клеточного цикла, к стадии G1, когдастановится возможным скрещивание дрожжевых клеток, модификации основаниймогут сохраниться в неизмененном виде и проявиться фенотипически. Хотяпервичные повреждения, индуцированные УФ излучением, блокируют синтезДНК, осуществляемый репликативными ДНК-полимеразами, они могутсохраниться в ДНК на стадиях S и G2 благодаря механизмам, обеспечивающимвременную устойчивость к повреждениям (Swanson et al., 1999; Yu et al., 2001; Liand Heyer, 2008; Waters et al., 2009; Ikehata and Ono, 2011), и проявитьсяфенотипически на стадии G1 в следующем клеточном цикле.

Двунитевые разрывыДНК обязательно должны быть устранены посредством гомологичнойрекомбинации на стадии G2 клеточного цикла (Friedberg et al., 2006). Двунитевыеразрывы не способны сохранятся в ДНК при переходе из стадии S в G2 и M(Zierhut and Diffley, 2008). Даже если клетки с небольшим числом двунитевыхразрывов успевают пройти чекпойнт G2/M до его активации и вступают в деление,то в ходе деления происходит потеря хромосомы III или её плеча, что приведет кпереключению типа спаривания и "незаконному" скрещиванию в следующей заэтим митозом стадии G1. Двунитевые разрывы, возникшие за пределами стадииG1, не имеют самостоятельного фенотипического проявления в альфа-тесте, онипревращаются в наследуемые изменения, которые и учитываются в альфа-тесте.Двунитевые разрывы могут проявиться фенотипически в альфа-тесте только еслиони возникли на стадии G1 и привели к переключению типа спаривания на этой жестадии клеточного цикла.ЗАКЛЮЧЕНИЕС использованием альфа-теста мы оценили спектр и частоту наследуемых иненаследуемых изменений генетического материала, как следствие индукциипервичных повреждений ДНК различных типов.