Автореферат (Фенотипическое проявление повреждений генетического материала, учитываемых в альфа-тесте у дрожжей Saccharomyces cerevisiae), страница 2

Самостоятельное фенотипическое проявление первичныхповреждений, возникших на стадиях S, G2 или М, может быть зафиксировано вальфа-тесте, если эти повреждения могут сохраняться в клеточном цикле доследующей стадии G1, в которой становится возможным их проявление.Степеньдостоверностииапробациярезультатов.Данные,представленные в диссертации, опубликованы в трех статьях, в том числе, двестатьи опубликованы в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.Материалы работы были представлены и доложены на восьми международных иВсероссийских конференциях. Достоверность экспериментальных данных,представленных в диссертации, подтверждена воспроизводимостью результатовэкспериментов и доказана с применением методов математической статистики исовременного программного обеспечения.Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 146 страницахи включает следующие разделы: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы иметоды", "Результаты", "Обсуждение", "Заключение", "Выводы", "Списоклитературы", и "Приложения". В тексте представлено 38 рисунков и 3 таблицы.Приложение состоит из 15 таблиц. Список литературы содержит 221 источник.ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫМатериалы и методыШтаммы.

В работе в качестве базовых использовали следующие штаммы:K5-35B-Д924 (MATα ura3Δ leu2Δ met15Δ lys5::KanMX cyhr) и его производные втестах на незаконную гибридизацию; K5-35B-Д924-kar1-1 (MATα ura3Δ leu2Δmet15Δ lys5::KanMX cyhr kar1-1 [rho-]) и его производные в тестах на незаконную6цитодукцию; Д926 (MATα//MATα ADE1//ade1Δ leu2∆//leu2∆ lys2∆//lys2∆ura3∆//ura3∆ his4∆//his4∆ thr4∆//thr4∆ CYHs [rho+]) в качестве партнера дляскрещивания в тестах на "незаконную" гибридизацию и цитодукцию.Генетические и микробиологические методы. В работе использовалистандартные методы и культуральные среды, применяемые при работе с дрожжамии бактериями (Sherman et al., 1986; Rose et al., 1990; Green and Sambrook, 2012).Молекулярно-генетические методы.

Трансформацию клеток дрожжейпроводили по стандартной методике с модификациями (Rose et al., 1990). В ходеисследований были использованы вспомогательные молекулярно-генетическиеметоды: гель-электрофорез ДНК, трансформация клеток бактерий, выделениеплазмидной ДНК из E.

coli, которые проводили по стандартным протоколам (Greenand Sambrook, 2012). Для оценки степени синхронизации дрожжевых культуриспользовали два метода: микроскопию с флуоресцентной окраской DAPI ипроточную цитометрию (Futcher, 1999; Haase and Reed, 2002).Альфа-тест. Альфа-тест основан на использовании особенностейгенетического контроля типа спаривания у дрожжей S.

cerevisiae. Согласнопринятой модели альфа-теста, в клетках, подвергшихся генотоксическомувоздействию, первичные повреждения ДНК нарушают экспрессию локуса MATα,что приводит к временному переключению типа спаривания α → а, и делаетвозможным "незаконное" скрещивание клеток двух штаммов, исходно имевшихтип спаривания α. Значительную часть первичных повреждений ДНК системырепарации устраняет безошибочно – происходит восстановление структуры ДНК ивозвращение дрожжевых клеток к исходному фенотипу α. Тем не менее, за времясвоего существования первичные повреждения успевают проявиться каквременное переключение типа спаривания α → а.

Меньшая часть регистрируемыхв альфа-тесте первичных повреждений в ходе репарации закрепляется в виденаследуемых изменений генетического материала: генных мутаций илихромосомных аберраций (потери хромосомы III или ее правого плеча), а такжепровоцирует конверсию и рекомбинацию (Инге-Вечтомов и др., 1986; Степченковаи др., 2011). Все эти генетические события могут быть выявлены с помощьюальфа-теста, включающего две взаимодополняющих системы: тест на"незаконную" гибридизацию и тест на "незаконную" цитодукцию. В альфа-тестеиспользуют два штамма гетероталличных дрожжей одинакового типа спаривания αс комплементарными селективными маркерами и маркированной хромосомой III.Один из штаммов подвергают генотоксическому воздействию и скрещивают совторым на селективной среде, где вырастают только гибриды, но не родительскиештаммы.

Частота "незаконной" гибридизации и цитодукции отражает общуючастоту первичных повреждений ДНК в локусе МАТα, а анализ фенотипа"незаконных" гибридов и цитодуктантов позволяет идентифицироватьгенетические события, приведшие к временному или наследуемому переключениютипаспаривания.Тестна"незаконную"гибридизациюпозволяетидентифицировать потерю всей хромосомы III или ее правого плеча вместе слокусом МАТα, рекомбинацию и конверсию между кассетой HMRa и локусомМАТα, а также совместно генные мутации и первичные повреждения в локусеМАТα, поскольку гибриды, возникшие в результате этих событий, имеютодинаковый фенотип.

Различить генные мутации и первичные повреждения можнов тесте на "незаконную" цитодукцию, а также выявить генные мутации,произошедшие в двустороннем промоторе локуса МАТα или одновременно в7MATα1 и MATα2, и одиночные мутации в MATα1 или MATα2. В данной работеоценку общей частоты "незаконной" гибридизации и цитодукции, а также частотыотдельных событий, учитываемых в альфа тесте, проводили как описано ранее(Степченкова и др., 2009; Kochenova et al., 2011).Для статистической обработки данных использовали стандартные методывычисления медиан и оценки доверительных интервалов для медиан (Гланц, 1999;Буре и Парилина, 2013). Достоверность различий между значениями частотспонтанных и индуцированных при различных воздействиях определяли спомощью непараметрических критериев Манна-Уитни, Краскела-Уолиса,Вилкоксона, при уровне значимости P=0,05 (Гмурман, 2003), Достоверностьотличий между сравниваемыми долями определяли с помощью z критерия споправкой на непрерывность (Гланц, 1999; Гмурман, 2003).РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕДля того чтобы определить молекулярную природу первичных поврежденийДНК, способных проявляться фенотипически, мы исследовали влияние эталонныхмутагенов, вызывающих повреждения определенного типа, и дефектов различныхсистем репарации на спектр изменений генетического материала, приводящих кпереключению типа спаривания α → а у дрожжей S.

cerevisiae. О факте временногоили наследуемого переключения типа спаривания α → а судили по возникновению"незаконных" гибридов и цитодуктантов при скрещивании двух штаммов α типаспаривания в селективных условиях. В работе мы учитывали события, приводящиек переключению типа спаривания, двумя способами. Во-первых, определялиобщую частоту "незаконной" гибридизации или цитодукции, которыепредставляют собой отношение числа "незаконных" гибридов или цитодуктантов,соответственно, к числу выживших клеток.

Во-вторых, определяли долю каждогокласса от числа проверенных "незаконных" гибридов или цитодуктантов, а такжечастоту каждого класса. Мы определяли соотношение наследуемых иненаследуемых изменений генетического материала, наблюдаемое при воздействиигенотоксических факторов по сравнению с контрольным вариантом без обработкимутагенами. На основе полученных результатов делали выводы о способностипервичных повреждений проявляться фенотипически.1.

Молекулярная природа первичных повреждений, способных проявлятьсяфенотипически1.1. Исследование фенотипического проявления модификаций основанийДНК, индуцированных аналогами оснований, системах "незаконной"гибридизации и "незаконной" цитодукцииВозможность фенотипического проявления модификаций оснований вальфа-тесте изучали на примере двух аналогов оснований 8-оксогуанина (8-ОГ) и6-N-гидроксиламинопурина (ГАП). ГАП – аналог аденина, который в форменуклеотида встраивается в ДНК при репликации напротив тимина или цитозина.

Удрожжей, будучи встроенным в ДНК, ГАП индуцирует исключительно генныемутации типа транзиций GC → АТ или AT → GC (Pavlov et al., 1991; Lada et al.,2013). Мы показали, что в альфа-тесте ГАП повышает частоту наследуемыхизменений генетического материала, в основном генных мутаций, и частотуненаследуемых- временных повреждений в локусе MATα (рисунок 1 А, Б). Мынаблюдали не только возрастание частоты временных повреждений при действииГАП, но увеличение их доли по сравнению со спонтанным уровнем.8Рисунок 1.

Отношение частоты наследуемых и ненаследуемых измененийгенетического материала при воздействии мутагенным фактором к частоте тех жесобытий, возникающих спонтанно в тестах на (А) "незаконную" гибридизацию и(Б) "незаконную" цитодукцию. F-частота генетических событий, учитываемых втестах на "незаконную" гибридизацию или цитодукцию. * – значения достоверноотличаются по критерию Манна-Уитни (Р<0,05) от значения частоты тех жесобытий, возникших спонтанно.8-ОГ образуется в результате окисления гуанина активными формамикислорода как непосредственно в ДНК, так и в пуле нуклеотидов (Haracska et al.,2000). При репликации 8-ОГ может образовывать пары не только с цитозином, но ис аденином, что приводит к трансверсиям GC → TA. 8-ОГ может быть удален изДНК посредством активности специфической ДНК-гликозилазы, кодируемойгеном OGG1. У мутантов по гену OGG1 происходит накопление эндогенного 8-ОГв ДНК (Boiteux et al., 2002). Поэтому для того, чтобы изучить возможностьфенотипического проявления 8-ОГ в альфа-тесте мы использовали штаммыдрожжей, несущие делецию гена OGG1, у которых не происходит вырезаниемодифицированного основания из ДНК.

Мы показали, что мутация ogg1 повышаетчастоту временных повреждений, генных мутаций и не приводит к изменениючастоты потери хромосомы III и ее правого плеча (рисунок 1 А, Б), чтосоответствует нашим ожиданиям, основанным на литературных данных.Таким образом, в данной работе мы показали, что модификации азотистыхоснований ДНК могут самостоятельно проявляться фенотипически в альфа-тестееще до их устранения системами репарации. При этом большая доля первичныхповреждений, индуцированных аналогами оснований, учитывается в альфа-тестекак временные повреждения, а оставшаяся часть первичных повреждений в ходенетождественной репарации превращается в точечные мутации, что согласуется слитературными данными (Boiteux et al., 2002; Lada et al., 2013).1.2.