Автореферат (Фенотипическое проявление повреждений генетического материала, учитываемых в альфа-тесте у дрожжей Saccharomyces cerevisiae)

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТНа правах рукописиЖук Анна СергеевнаФЕНОТИПИЧЕСКОЕ ПРОЯВЛЕНИЕ ПОВРЕЖДЕНИЙ ГЕНЕТИЧЕСКОГОМАТЕРИАЛА, УЧИТЫВАЕМЫХ В АЛЬФА-ТЕСТЕ У ДРОЖЖЕЙSACCHAROMYCES CEREVISIAEспециальность: 03.02.07 - генетикаАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата биологических наукСанкт-Петербург2016Работа выполнена на кафедре генетики и биотехнологии биологическогофакультета Федерального государственного бюджетного образовательногоучреждения высшего образования "Санкт-Петербургский государственныйуниверситет"Научныйруководитель:доктор биологических наук, профессор, академик РАН,Инге-Вечтомов Сергей Георгиевич, профессор кафедрыгенетики и биотехнологии, Федеральное государственноебюджетноеобразовательноеучреждениевысшегообразования "Санкт-Петербургский государственныйуниверситет"Официальныеоппоненты:доктор биологических наук, профессор,Ким Александр Иннокентьевич, профессор кафедры генетики,Федеральное государственное бюджетное образовательноеучреждениевысшегообразования"Московскийгосударственный университет им.

М.В.Ломоносова"доктор биологических наук, профессор, академик РАЕН,заслуженный деятель науки РФ,Ревазова Юлия Анатольевна, ведущий научный сотрудникотдела генетической токсикологии, Федеральное бюджетноеучреждение науки "Федеральный научный центр гигиены им.Ф.Ф. Эрисмана" РоспотребнадзораВедущаяорганизация:Федеральное государственное бюджетное учреждение"Петербургский институт ядерной физики им.

Б.П.Константинова", Национальный исследовательский центр"Курчатовский институт"Защита диссертации состоится ___________________ 2016 г. вчасов назаседании совета Д.212.232.12. по защите докторских и кандидатских диссертацийпри Санкт-Петербургском Государственном университете по адресу: 199034Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9, СПбГУ, биологический факультет,кафедра генетики и биотехнологии, аудитория 1.С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке им.

М. ГорькогоСанкт-Петербургского Государственного университета и на сайте СанктПетербургского государственного университета (http://spbu.ru/).Автореферат разослан ___________________ 2016 г.Ученый секретарьдиссертационного советаД.212.232.12,доктор биологическихнаукМамон Людмила Андреевна3ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность темы. Живые организмы постоянно испытываютразнообразные воздействия генетически активных факторов, которые нарушаютстабильность генома (Абилев и Глазер, 2015). Изменение темпов мутирования поддействием экзогенных и эндогенных факторов может существенно отразиться начисленности и генетической структуре популяции, а также здоровье человека иприспособленности растений и животных к условиям обитания. Дестабилизациягенетическогоматериалаявляетсяпричинойвозникновениямногихнаследственных и онкологических заболеваний человека, а также приводит кснижению жизнеспособности организмов и ускоряет процесс старения клеток(Friedberg et al., 2006; Hoeijmakers, 2009; Bernstein et al., 2013).

Согласносовременным представлениям, в основе абсолютного большинства наследуемыхизменений генетического материала лежат первичные повреждения ДНК, такие какодно- и двунитевые разрывы ДНК, модификации оснований, пиримидиновыедимеры, 6-4 фотопродукты, аддукты, разрывы сахаро-фосфатного остова молекулыДНК (Pages and Fuchs, 2002; Friedberg et al., 2006). Процесс устранения первичныхповреждений ДНК включает несколько этапов и может занимать длительное время.В результате репарации поврежденной ДНК первичные повреждения либобесследно устраняются, либо превращаются в генные мутации и хромосомныеперестройки, или индуцируют реципрокную рекомбинацию, что приводит кизменению фенотипических признаков организма (Friedberg et al., 2006).

Влияниенаследуемых изменений генетического материала на фенотип организмов изученодостаточно хорошо, но данные о характере и механизмах фенотипическогопроявления первичных повреждений ДНК ещё до момента их превращения вмутации или устранения системами репарации практически отсутствуют. Длярешения этой актуальной задачи мы применили подход, разработанный на кафедрегенетики и биотехнологии Санкт-Петербургского государственного университета,который получил название альфа-тест.Степень разработанности темы. Хорошо изучены последствия накоплениягенных и геномных мутаций в канцерогенезе, выявлены мутантные аллелинекоторых генов, которые тесно связаны с риском развития наследственных ионкологических заболеваний (Friedberg et al. 2006; Pierce, 2012; Alberts et al., 2015).Тем не менее, первые этапы становления генных и геномных мутаций (Лобашев,1946), а именно: механизмы возникновения и взаимопревращения первичных(предмутационных) повреждений ДНК, а также временны̀е параметры иэффективность их устранения системами репарации – требуют дальнейшего болееглубокого изучения.

В настоящее время разработано много методов длярегистрации генных и геномных мутаций различных типов (Kumari et al., 2008), ноиз-за врѐменного характера первичных повреждений эти методы не позволяютпрослеживать весь процесс превращения первичных повреждений ДНК внаследуемые изменения генетического материала, а также сопоставлятьфенотипическое проявление первичных повреждений и наследуемых измененийгенетического материала. Альфа-тест – единственная из известных систем,позволяющая регистрировать фенотипическое проявление первичных поврежденийДНК и отличать его от проявления наследуемых изменений генетическогоматериала.

К настоящему времени продемонстрирована эффективность альфатеста для выявления генетически активных физических и химических факторов, атакже для изучения результата инактивации ряда генов системы синтеза ДНК в4обход повреждений и репарации ДНК с двунитевыми разрывами (Степченкова идр., 2009; Kochenova et al., 2011). Данные, полученные нами ранее, подтверждают,что альфа-тест является адекватным подходом для регистрации фенотипическогопроявления первичных повреждений ДНК и наследуемых измененийгенетического материала, возникающих как спонтанно, так и при воздействииразличными мутагенами.Цель и задачи исследований. Цель диссертационной работы: изучитьхарактер фенотипического проявления первичных повреждений генетическогоматериала и их вклада в наследственную и модификационную изменчивость удрожжей Saccharomyces cerevisiae с использованием альфа-теста.Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи:1.

Оценить способность первичных повреждений различных типов:модификаций оснований, двунитевых разрывов, пиримидиновых димеров,индуцированных эталонными мутагенами, а также модификаций и неспаренностейоснований, возникших на фоне дефектов систем репарации, проявлятьсяфенотипически.2. Определить временные параметры процесса устранения ифенотипического проявления первичных повреждений относительно стадийклеточного цикла.Научная новизна. В представленной работе впервые установленамолекулярная природа первичных повреждений ДНК, способных проявлятьсяфенотипически в альфа-тесте, а также исследована возможность ихфенотипического проявления в зависимости от стадии клеточного цикла, накоторой возникли повреждения. Впервые с использованием изогенных штаммовдрожжей было проведено комплексное исследование эталонных мутагенов идефектов систем репарации в альфа-тесте, состоящем из двух взаимодополняющихсистем: тестов на "незаконную" гибридизацию и "незаконную" цитодукцию.Дополнительно в ходе исследования было установлено, что дрожжевые клетки,потерявшие хромосому III, способны вступать в гибридизацию.Теоретическая и практическая значимость работы.

Изучение процессапреобразования первичного повреждения в наследуемое изменение генетическогоматериала представляет особый интерес, как с теоретической, так и с практическойточек зрения. Исследования в этой области важны для понимания механизмовстановления мутаций, реципрокной и других типов рекомбинации и иныхнарушений генетического материала, а также для дальнейшего развитиягенетической токсикологии и исследования механизмов, блокирующих мутагенез.Полученные результаты вносят вклад в развитие теории мутационного процесса, атакже будут полезны для дальнейшего изучения взаимодействия системрепликации и репарации генетического материала, и исследования точностирепарации, и понимания фундаментальных механизмов изменчивости.

Результатыработы могут быть использованы в исследованиях в области общей биологии игенетики, мониторинга состояния окружающей среды, а также для разработки исовершенствования систем тестирования генетической активности факторов,обладающих потенциальной мутагенной и канцерогенной активностью, чтонеобходимо для защиты генома человека и животных от эндогенных и экзогенныхмутагенных факторов.

Полученные нами результаты могут быть использованы влекциях по курсам "Репликация, репарация и мутагенез", "Молекулярнаягенетика", "Частная генетика дрожжей", "Механизмы модификаций. К общей5теории изменчивости", читаемых на кафедре генетики и биотехнологии СанктПетербургского государственного университета, а также в образовательномпроцессе в биологических и медицинских высших учебных заведениях России.Методология и методы исследования.

В представленной работеиспользован интегральный подход, сочетающий методы классической имолекулярной генетики, современные молекулярно-генетические и цитологическиеподходы. В работе использован широкий спектр молекулярно-генетическихметодов (клонирование генов, трансформация клеток дрожжей и бактерий,полимеразная цепная реакция, методы по дизайну праймеров и плазмид, методиндукции потери хромосом), методы флуоресцентной микроскопии, проточнаяцитометрия, компьютерный анализ данных и статистические методы для оценкидостоверности результатов. Исследование проводили с использованием в качествемодельного объекта эукариотических микроорганизмов грибов Saccharomycescerevisiae.Положения, выносимые на защиту.

Модификации оснований идвунитевые разрывы ДНК могут проявляться фенотипически в альфа-тесте до ихустранения системами репарации или превращения в наследуемые изменениягенетического материала. Неспаренности оснований не имеют самостоятельногофенотипического проявления в альфа-тесте и могут быть учтены только после ихпревращения в наследуемые изменения генетического материала. В зависимости отмолекулярной природы первичного повреждения и связанной с этим егоспособностью нарушать матричные процессы, большинство первичныхповреждений могут фенотипически проявляться в альфа-тесте в пределах одногоклеточного цикла. Если первичное повреждение произошло на стадии G1, товероятность его самостоятельного фенотипического проявления в альфа-тестеявляется максимальной.