Автореферат (1145827), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Влияние инактивации репарации ДНК с неспаренными основаниями начастоту наследуемых и ненаследуемых изменений генетического материала,выявляемых в системах "незаконной" гибридизации и "незаконной"цитодукцииДля определения возможности фенотипического проявления неспаренностейоснований мы изучили в альфа-тесте эффект инактивации гена PMS1,кодирующего один из основных белков системы репарации ДНК с неспареннымиоснованиями (MMR – mismatch repair).
Субстратом белков MMR являются9неканонические пары между нормальными или модифицированными основаниями.Главным образом неканонические пары оснований возникают в результате ошибокрепликации (Fukui, 2010). У дрожжей белок, кодируемый геном PMS1, являетсякомпонентом гетеродимера MutLα (Mlh1-Pms1), который играет ключевую роль восуществлении репарации ДНК с неспаренными основаниями. Этот комплексвносит разрез с 3' или 5' стороны от неспаренного нуклеотида на вновьсинтезированной цепи ДНК, затем экзонуклеаза Exo1 вырезает поврежденныйучасток ДНК.
Образовавшуюся однонитевую брешь застраивает ДНК-полимеразаδ, а ДНК-лигаза 1 лигирует однонитевые разрывы (Fukui, 2010). У мутантов погену PMS1 происходит накопление неспаренностей оснований в ДНК и, какследствие, повышение частоты замен нуклеотидов.С использованием альфа-теста мы показали, что делеция гена PMS1повышает частоту потери хромосомы III и ее правого плеча, генных мутаций, иснижает частоту временных повреждений (рисунок 2 А, Б). Доля временныхповреждений у штамма pms1 снижается, а доля мутаций в общем числеучитываемых событий возрастает по сравнению со штаммом дикого типа.Рисунок 2. Частота наследуемых и ненаследуемых изменений генетическогоматериала у штаммов дикого типа wt и с мутацией pms1 в тестах на (А)"незаконную" гибридизацию и (Б) "незаконную" цитодукцию.
* – значениядостоверно отличаются по критерию Манна-Уитни (Р<0,05) от значения частотытех же событий, возникших спонтанно.Таким образом, изучение эффекта инактивации MMR в альфа-тестепоказало, что неспаренности оснований приводят к повышению частоты"незаконного" скрещивания, которое происходит исключительно за счетнаследуемых генетических изменений. Отсутствие индукции частоты временныхповреждений у мутанта pms1 указывает на то, что неспаренности оснований неимеют собственного фенотипического проявления в альфа-тесте. Это согласуется слитературными данными.1.3.
Исследование фенотипического проявления двунитевых разрывов ДНК всистемах "незаконной" гибридизации и "незаконной" цитодукцииС целью изучения возможности фенотипического проявления двунитевыхразрывов мы исследовали в альфа-тесте эффект ингибитора ДНК-топоизомеразы I10– камптотецина. В ходе репликации, транскрипции и структурной реорганизациихроматина в ДНК при расплетении двух комплементарных цепей возникаетсуперспирализация, которую устраняет топоизомераза I.
Топоизомераза I вноситоднонитевой разрыв в ДНК, что позволяет спирали ДНК вращаться вокругинтактной цепи и снижает плотность суперспирализации ДНК. После релаксациитопоизомераза I соединяет разрезанные концы ДНК (Pommier, 2006). Камптотецинковалентно связывается с топоизомеразой I и ДНК. Это предотвращаетлигирование ДНК, приводит к блоку вилки репликации и накоплению двунитевыхразрывов ДНК. Камптотецин также приводит к остановке РНК-полимеразы и блокуэлонгации транскрипции, при этом накапливается негативная суперспирализацияДНК, индуцирующая формирование R-петель, которые стимулируютвозникновение двунитевых разрывов (Pommier, 2006; Sordet et al., 2010; Tomicicand Kaina, 2013). Камптотецин блокирует синтез как ДНК, так и РНК, но оннаиболее токсичен в стадии S клеточного цикла (Squires et al., 1993).Мы показали, что ингибитор топоизомеразы I существенно индуцирует какнаследуемые, так и ненаследуемые изменения генетического материала,учитываемые в альфа-тесте, – потерю хромосомы III и ее правого плеча,рекомбинацию и конверсию, генные мутации и временные повреждения (рисунок 3А, Б).
При воздействии камптотецином доля класса "временные повреждения"возрастает по сравнению со спонтанным уровнем.Рисунок 3. Частота наследуемых и ненаследуемых изменений генетическогоматериала, возникших при воздействии камптотецином и спонтанно в тестах на (А)"незаконную" гибридизацию и (Б) "незаконную" цитодукцию. * – значениядостоверно отличаются по критерию Манна-Уитни (Р<0,05) от значения частотытех же событий, возникших спонтанно.Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод о том, чтодвунитевые разрывы, индуцированные камптотецином, способны приводить квременному переключению типа спаривания α → а, т.е. могут проявлятьсяфенотипически.1.4. Изучение природы "незаконных" гибридов, потерявших хромосому IIIОдним из наиболее частых генетических событий, учитываемых в альфатесте, является потеря хромосомы III. Доля гибридов, лишенных хромосомы III, в11общем числе "незаконных" гибридов, возникающих спонтанно или под действиемгенотоксических факторов, составляет от 30 до 50 % (Yuen et al., 2007; Kochenovaet al., 2011).
Для того чтобы проверить гипотезу о том, что потеря хромосомы IIIможет являться первичным событием, которое приводит к переключению типаспаривания и образованию "незаконного" гибрида, мы применили оригинальныйподход, заключающийся в индукции направленной потери хромосомы III безприменения агентов, повреждающих ДНК. Известно, что транскрипция вцентромерном районе хромосомы нарушает нормальное прикрепление веретенаделения к кинетохору, это нарушает нормальное распределение хромосом вмитозе, приводящее к существенному повышению частоты потери хромосомы(Reid et al., 2008). Мы исследовали эффект индукции потери хромосомы IIIпосредством встраивания регулируемого галактозного промотора (pGAL1) в еецентромеру.
Индукция транскрипции с галактозного промотора в полученном намиштамме K5-35B-Д924-cen3 происходит только на среде с галактозой, но не сглюкозой. Мы показали, что индукция транскрипции в центромере хромосомы IIIприводит к возрастанию частоты "незаконной" гибридизации в 5000 раз, т.е. неменее 5% всех клеток культуры, выращенной на среде с галактозой, теряютхромосому III, а потеряв ее, переключают тип спаривания α → а и вступают в"незаконное" скрещивание. На среде с глюкозой частота "незаконной"гибридизации и частота каждого из выявляемых классов "незаконных" гибридов уштамма, несущего промотор pGAL1 в центромере, не отличается отсоответствующих значений у штамма дикого типа (рисунок 4).Рисунок 4. Частота генетических событий, выявляемых в тесте на "незаконную"гибридизацию, у штамма дикого типа (wt) и штамма, несущего pGAL1 вцентромере хромосомы III, на среде с глюкозой (YEPD) или галактозой (YEPG).
* –значение частоты "незаконной" гибридизации достоверно отличается от частотытех же событий, возникших у штамма дикого типа на среде с галактозой иглюкозой (критерий Краскела-Уоллиса (Р<0,05)) и штамма K5-35B-Д924-cen3 насреде с глюкозой (критерий Вилкоксона (Р<0,05)).12На основе полученных нами данных можно сделать вывод о том, что клетки,потерявшие хромосому III, могут скрещиваться, а "незаконные" гибриды безхромосомы III могут возникать в альфа-тесте несколькими способами: потеряхромосомы III в результате нетождественной репарации первичных поврежденийДНК локуса MAT может происходить как до, так и после гибридизации клеток.Данные, полученные в экспериментах по изучению механизмавозникновения "незаконных" гибридов, лишенных хромосомы III, важны дляинтерпретации результатов изучения генотоксической активности камптотецина, вчастности, для понимания того, когда двунитевые разрывы, индуцированныекамптотецином, вызывают потерю хромосомы III (до или после скрещивания) имогут ли двунитевые разрывы проявляться фенотипически.
Анализ собственных илитературных данных позволил нам сделать вывод о том, что в тесте на"незаконную" цитодукцию при обработке клеток камптотецином мы фиксируемфенотипическое проявление тех двунитевых разрывов, которые возникают настадии G1 при блокировании камптотецином топоизомеразы I, участвующей нетолько в репликации, но и в транскрипции, а также структурной реорганизациихроматина (Wang, 2002; Sordet et al., 2010; Durand-Dubief et al., 2011). На основеданных, полученных при изучении эффекта камптотецина в тестах на"незаконную" гибридизацию и цитодукцию, можно заключить, что частьдвунитевых разрывов, индуцированных камптотецином, фенотипическипроявляется в альфа-тесте именно на уровне первичных повреждений.
Вероятностьфенотипического проявления двунитевых разрывов зависит от стадии клеточногоцикла, на котором возникло это повреждение.Таким образом, изучив в альфа-тесте эффекты эталонных мутагенов иблоков путей репарации, которые вызывают повреждения ДНК одногоопределенного типа, мы впервые определили молекулярную природу первичныхповреждений, которые способны проявляться фенотипически. Мы подтвердили,что изменение фенотипа клеток может происходить в результате возникновенияпервичных повреждений в ДНК до их устранения или превращения в наследуемыеизменения. Полученные результаты указывают на то, что первичные поврежденияразличных типов в разной степени влияют на фенотип.
Одним из существенныхфакторов, определяющих способность первичных повреждений проявлятьсяфенотипически, является степень вызываемых ими нарушений химическойструктуры ДНК. Нельзя исключать наличие других факторов, способныхмодифицировать фенотипическое проявление первичных повреждений. Мыпредположили, что длительность существования первичных повреждений домомента их устранения, а также дальнейшая судьба первичных повреждений послеустранения посредством репарации во многом зависит от стадий клеточного цикла,на которой возникли первичные повреждения.2. Изучение фенотипического проявления первичных поврежденийгенетического материала в клеточном циклеДля того, чтобы проследить судьбу первичных повреждений от момента ихвозникновения до устранения системами репарации в зависимости от стадииклеточного цикла, незаменимым инструментом оказался альфа-тест.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
