Диссертация (Разработка металл-аффинного сорбента на основе лантана для решения задач фосфопротеомики)

ШиловскихВладимир ВладимировичРазработка металл-аффинного сорбента на основе лантана для решениязадач фосфопротеомики.Диссертация на соискание ученой степеникандидата химических наук02.00.11 – коллоидная химияНаучный руководитель:к.х.н. Суходолов Николай ГеннадьевичСанкт-Петербург2017ОглавлениеВведение ................................................................................................................... 7Актуальность работы .............................................................................................. 9Научная новизна работы ......................................................................................

11Практическая значимость работы ....................................................................... 12Основные положения, выносимые на защиту .................................................... 12Апробация работы ................................................................................................. 13Публикации ............................................................................................................

13Благодарности........................................................................................................ 13Литературный обзор .................................................................................... 141.1.1. Общие сведения о сорбции ...................................................................... 141.2. Металл-аффинная адсорбция .................................................................. 171.3. Фосфорорганические отравляющие вещества ...................................... 181.3.1.Физические свойства и история разработки боевых ФОВ ............

191.3.2.Механизм действия ............................................................................ 201.3.3.Реакция зарина с АХЭ ....................................................................... 211.3.4.Взаимодействие с эстеразами ........................................................... 251.4. Аналитические методы определения ФОВ и продуктов воздействияФОВ на организм ...............................................................................................

261.4.1.Масс-спектрометрия в фосфопротеомике ....................................... 281.4.2.Электроспрей ...................................................................................... 281.4.3.Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация .......... 291.5. Сорбционная очистка и концентрирование ........................................... 331.5.1.Металл-аффинные сорбенты ............................................................. 331.5.2.Металл-оксидные сорбенты .............................................................. 352Металл-хелатные сорбенты...............................................................

381.5.3.1.6. Тонкие пленки ........................................................................................... 401.6.1.Получение тонких пленок ................................................................. 401.6.2.История метода Ленгмюра-Блоджетт .............................................. 401.6.3.Свойства пленок Ленгмюра-Блоджетт............................................. 41Экспериментальная часть ...........................................................................

472.2.1. Материалы и методы исследований ....................................................... 472.2. Методы исследования физико-химических свойств ............................ 492.2.1.Получение монослоев стеарата лантана .......................................... 492.2.2.Исследование структурного звена монослоя стеарата лантана .... 492.2.3.Стандартизация монослоёв стеарата лантана .................................

502.2.4.Измерение удельной поверхности стеарата лантана методомнизкотемпературной адсорбции азота ................................................................ 502.2.5.Изотермы сжатия монослоев стеарата лантана............................... 502.2.6.Определение изоэлектрической точки для стеарата лантана ........ 512.2.7.Исследование устойчивости пленок стеарата лантана в различныхрастворителях ........................................................................................................

512.2.8.Сканирующаяэлектроннаямикроскопияколлапсированныхпленок стеарата лантана ....................................................................................... 522.2.9.Микроволновый синтез дисперсного хромита лантана ................. 532.2.10.Рентген-дифракционное определение хромита лантана ................ 542.2.11.Исследование хромита лантана методом лазерной дифракции ....

542.2.12.Определение площади поверхности хромита лантана методомнизкотемпературной адсорбции криптона ......................................................... 542.2.13.Сканирующая электронная микроскопия хромита лантана .......... 5532.3. Методы исследования сорбционной способности ................................ 56Количественное определение сорбционной емкости пленочного2.3.1.стеарата лантана по фосфорилированному пептиду методом ВЭЖХ УФ .....

562.3.2.Десорбция с перерастворением сорбента ........................................ 572.3.3.Определение сорбционной способности стеарата лантана побычьему казеину методом АСМ .......................................................................... 57Качественный масс-спектрометрический анализ сорбционной2.3.4.способности стеарата лантана методом МАЛДИ МС ....................................... 58Качественное определение сорбционной способности хромита2.3.5.лантана по фосфорилированному пептиду методом МАЛДИ МС ..................

58Обсуждение результатов ............................................................................. 603.3.1. Получение монослоев стеарата лантана ................................................ 603.2. Определение условий получения сорбента ........................................... 653.3. Определение электрокинетического потенциала .................................. 663.4. Определение устойчивости сорбента в растворителях ........................ 693.5. Сканирующая электронная микроскопия пленок стеарата лантана ...

713.6. Микроволновый синтез хромита лантана .............................................. 743.7. Определение фазового состава хромита лантана .................................. 753.8. Определение размера частиц хромита лантана методом лазернойдифракции ........................................................................................................... 763.9. Сканирующая электронная микроскопия хромита лантана ................

773.10.Исследование сорбции и десорбции казеина с поверхности пленокстеарата лантана методом атомно-силовой микроскопии ............................. 803.11.Количественноеопределениесорбцииидесорбциифосфорилированных пептидов пленками стеарата лантана методом ВЭЖХУФ8243.12.Исследование сорбции аддуктов ФОВ с сывороточным альбуминомчеловека на монослоях стеарата лантана ........................................................

833.13.Исследование сорбции аддуктов ФОВ с сывороточным альбуминомчеловека на хромите лантана ............................................................................ 843.14.Обоснование выбора сорбента для дальнейших исследований ....... 863.15Выделение аддуктов сывороточного альбумина человека с ФОВметодом металл-аффинной хроматографии на монослоях стеарата лантана(определение условий сорбции-десорбции) .................................................... 873.15.1 Определение условий сорбции фосфонилированных пептидов изпептическогогидролизатасыворочногоальбуминачеловека,модифицированного зоманом, на монослоях стеарата лантана .......................

873.15.2Определение условий десорбции фосфонилированных пептидовсыворочного альбумина человека, модифицированного зоманом, с монослоевстеарата лантана .................................................................................................... 903.15.3ИсследованиевозможностидесорбцииаддуктовФОСссывороточным альбумином человека с сорбента путем разрушения структурымонослоев 923.15.4Оптимизация методики металл-аффинной хроматографии .......... 943.15.5Металл-аффинная хроматография на МАЛДИ мишени ................

993.16Исследование возможности выделения методом металл-аффиннойхроматографии аддуктов холинэстеразы с ФОВ .......................................... 1023.16.1Исследованиесорбцииидесорбциибутирилхолинэстеразылошади, модифицированной RVx, методом атомно-силовой микроскопии 1023.16.2Исследование возможности выделения аддуктов холинэстеразы сзоманом методом металл-аффинной хроматографии на монослоях стеараталантана10353.16.3Сравнение специфичных свойств монослоев стеарата лантана скоммерчески доступными металл-аффинными сорбентами .......................... 107Основные результаты .........................................................................................

108Список сокращений ............................................................................................ 109Приложение ......................................................................................................... 110Список литературы ............................................................................................. 1116ВведениеБурное развитие химической технологии в XX и XXI веке,проникновение синтетических материалов во все сферы человеческой жизниостро ставят вопрос определения воздействия таких веществ на человеческийорганизм. Ввиду повсеместной индустриализации и кардинального изменениячеловеком окружающей среды становятся особенно актуальными вопросыдлительного воздействия микроколичеств опасных веществ на организмчеловека и определение первопричин, вызвавших те или иные отложенныепоследствия.

Так, оказалось, что многие вещества, не образующиеся вприроде, имеют кумулятивный эффект, могут широко мигрировать своздушными аэрозолями, сточными водами и вызывать целый спектрразличных нарушений, осложнений и болезней [1, 2, 3].Современное развитие новых аналитических методов, таких, как металлаффиннаяхроматографияиматрично-активированнаялазернаядесорбция/ионизация (МАЛДИ) масс-спектрометрия, позволяют вплотнуюподойти к решению проблемы точного определения биоорганическихсоединений, отличающихся большой сложностью строения и, одновременно,высочайшим сродством к определенным биологическим молекулам –протеомному анализу [4]. Одним из препятствий, стоящих на пути решениязадач направленного протеомного анализа, является огромное разнообразиебелкового состава биологических жидкостей и низкие концентрациипродуктов взаимодействия опасных веществ в организме человека.

Дляпреодоления этого препятствия исследуемые компоненты необходимовыделятьиконцентрировать.Основнойстратегиейдляразделениямикроколичеств белков в настоящее время считается использованиевысокоселективной сорбции, что, в свою очередь, требует специфичных длязаданных классов соединений сорбентов.Востребованной в настоящее время задачей является определениеследовыхколичествфосфорилированных7пептидов–продуктоввзаимодействия фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ) – вбиологических образцах [5, 6].

Сорбент на основе трехвалентных ионовредкоземельных металлов, согласно теории жёстких и мягких кислот иоснований Пирсона, должен хорошо подойти в качестве сорбента дляфосфорилированных пептидов [7].В распространенных в настоящее время сорбентах сорбционные центрыи функциональные группы могут находиться в различных позициях наповерхности сорбента, иметь различное геометрическое и химическоеокружение, что влияет на селективность сорбции.