Диссертация (1150378), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Этот подход показал себя чрезвычайноуспешным на практике при ликвидации последствий террористических атак вТокио 1994 и 1995 годов. Так, в случае получения образцов в течениенескольких часов, удалось достичь значений предела обнаружения до 1-4нг/млдля изопропилметилфосфоновой кислоты [38]. Существуют и другиеметодики определения продуктов метаболизма – в частности, рамановскаяспектроскопия[39]намодифицированнойподложкеиззолотыхнаностолбиков позволяет проводить высокочувствительный анализ.Однако некоторые фосфорорганические пестициды не являютсяпрямыми ингибиторами АХЭ. Так, три-о-крезил-фосфат, вызывающий схожиесимптомы отравления ФОВ, является ингибитором эстеразы PNPLA6, апестициды с длинными 12-20-цепочечными углеводородными заместителямиингибируют эстеразу FAAH [40], что требует более прямых методовопределения.
Кроме того, быстрое падение количества метаболитов непозволяет полагаться на вышеперечисленные методики в случаях, когда отборпроб не удается произвести в течение нескольких часов после отравления.Содержание аддуктов с эстеразами в крови изначально не достигает высокихконцентраций (кроме, конечно, летальных доз), но и спад концентрациипроисходит значительно медленнее, потому целесообразно рассматривать иболее универсальный метод определения протеиновых аддуктов. ИзначальнотакойанализпроводилсябутирилхолинэстеразесколориметрическихромогеномпоЭллманаингибированной(5,5'-дитиобис-(2-нитробензойная кислота)), однако он не позволяет обнаруживать низкиеконцентрации ингибированной эстеразы, неспецифичен и, кроме того, требуетналичия заранее полученной базовой линии [41].27Другим развившимся в конце XX – начале XXI века подходом копределению аддуктов ФОВ является масс-спектрометрия.
Открытые вовторойполовинеXXвекаметодымягкойионизации:матрично-активированная лазерная десорбция (1985 год) [42] и электроспрей (1968 год)[43],позволилирасширитьвозможностимасс-спектроскопиидляисследования термолабильных, сильно фрагментирующихся веществ имолекул большой массы.1.4.1. Масс-спектрометрия в фосфопротеомикеМасс-спектрометриявнастоящеевремяявляетсянаиболеераспространенным методом протеомного анализа, в том числе массспектроскопия даёт возможность определения множества органическихтоксинов и продуктов их воздействия на организм [44]. Высокая надежностьполучаемого результата и характеристичность сигнала для отдельногопептидаделаютмасс-спектрометриюнепревзойденнымметодомкачественного анализа, а использование совместно с высокоэффективнойжидкостной хроматографией – и количественного анализа. Ключевойпроблемой масс-спектроскопии для использования в протеомном анализеаддуктовФОВСоответственно,являетсяоченьнеобходиманизкаяконцентрацияпоследних.разработкаметодикобогащенияфосфорилированных пептидов.1.4.2.
ЭлектроспрейПринцип мягкой ионизации электроспреем состоит в следующем.Капилляр с наложенным внешним электрическим полем помещается в камеру.Биологический образец растворяется в протонном растворителе и наложенныйэлектрический градиент выталкивает каплю из капилляра вплоть до момента,когдаэлектростатическоеотталкиваниесильнозаряженнойкаплисравнивается с энергией поверхностного натяжения и происходит отрыв28капли. Затем растворитель испаряется, капля ступенчато фрагментируетсяраспадаясь каждый раз, когда электростатическое напряжение превышаетповерхностную энергию, так образец распадается вплоть до образованияистинных ионов по мере приближения к анализатору (рис.
6).Рисунок 6. Принципиальная схема метода электроспрея. 1 капилляр, 2образование конуса Тейлора, 3 первичная заряженная капля после отрыва откапилляра, давление в этой части камеры равно атмосферному, 4 заряженнаякапля достигает Релеевского предела с испарением растворителя, 5 каплидробятся, вплоть до отдельных ионов определяемого вещества 6 и попадают вкамеру масс-спектрометра.Поток анализируемого вещества поступает в камеру с небольшойскоростью от 5 нанолитров до 100 микролитров в секунду и может бытьобъединенсжидкостнымхроматографомдляхроматографическогоразделения смеси и непосредственного исследования элюата [45].Метод электроспрея затрудняется большой долей многозарядных ионови, соответственно, сильно осложненным спектром.1.4.3.
Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизацияМатрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (МАЛДИ)основана на сильном взаимодействии исследуемого вещества с некоторымивидами матричных молекул. В основном в методе МАЛДИ в качестве матрицыиспользуются вещества, отвечающие следующим требованиям:291). Обладают высокой оптической плотностью при длине волнылазерного излучения;2). Могут ионизировать молекулы анализируемого вещества путёмпереноса заряда или заряженной частицы;3). Хорошо растворимы в растворителях, используемых в процессепробоподготовки;4).
Химически не взаимодействуют с анализируемым веществом;5). Нелетучи, термически устойчивы.При непродолжительном облучении матрицы с веществом лазернымимпульсом высокой мощности происходит выброс вещества с поверхности.Сперваплотностьиспаренноговеществаблизкакплотностивконденсированном состоянии, при том, что энергия частиц много выше. Впервоначальном факеле содержится лишь малая доля ионизированных частиц– от 10-3 до 10-5, причем преимущественно ионизируются молекулы матрицы,однако в результате столкновений происходит вторичная ионизация икрупные частицы быстро распадаются до отдельных ионов (рис.
7) [45].Рисунок 7. Принципиальная схема метода МАЛДИ. Мишень 1,состоящая из молекул матрицы и определяемого вещества подвергаетсякороткому лазерному импульсу 2, в результате образуется факел 3, состоящийиз крупных агрегатов, которые дробятся 4 вплоть до отдельных ионов 5, затемпопадают в камеру времяпролётного масс-спектрометра.30Метод МАЛДИ МС может быть укомплектован твердыми, заранееподготовленными матрицами.
Анализ поддается автоматизации, не требуетсложной пробоподготовки. Однако, к недостаткам этого метода ионизацииотносится большой вклад низкомолекулярных матричных ионов в спектр.Впервые масс-спектроскопию для определения аддуктов применилипосле террористической атаки в Токийском метро 1995 года [46]. Тогда длязарина было показано, что обработка образца, содержащего аддукты ФОВ сэстеразами, раствором фторида калия в слабокислой среде приводит креактивациипептидаивысвобождениюзарина,которыйзатеманализировался методом газовой хроматографии с масс-спектроскопией (ГХМС).Такойжерезультатбылполучендляаддуктовзоманасбутирилхолинэстеразой и альбумином [47].Для прямого применения масс-спектроскопии для биологическихобразцовпредпочтительнееопределениебутирилхолинэстеразы–ееконцентрация в крови, как самом доступном материале для клиническихисследований, в десять раз выше, чем концентрация АХЭ, кроме того, АХЭсконцентрирована на мембранах красных и белых кровяных телец, в то времякакбутирилхолинэстеразаФосфорилированиепептидовнаходитсянегативнонепосредственновсказываетсяспособностинаплазме.модифицированных пептидов к ионизации, что приводит к падениюинтенсивности сигнала в масс-спектроскопии.
Причем эффект паденияинтенсивности сильнее заметен в методе МАЛДИ, чем в ионизацииэлектроспреем [48].Было проведено исследование плазмы человека, подвергшегосяотравлению зарином, методом электроспрея. Отделение короткого фрагментапроводилось с помощью пепсина в кислой среде. В результате обнаруженсигнал,соответствующий9-пептиднымпоследовательностямFGES198AGAAS с добавочной массой этоксифосфата – р состаренногоостатка ФОВ (рис. 8).31Рисунок 8.
Масс-спектр гидролизата аддукта табуна с АХЭ человекаподвергшегося процессу старения. Знак Δ указывает на пики, утратившиемолекулу ФОВ и молекулу воды с превращением серина в дегидроаланин [19].Проблемой такого метода является невозможность определенияконкретногоФОВ,т.к.впроцессестаренияразличныевеществапревращаются в один и тот же аддукт моноэтилфосфата, тот же процесспротекает в кислой среде при обработке образца пепсином (рис.
9).Рисунок9.Процессы,происходящиебутирилхолинэстеразы пепсином [19].32приобработкеаддуктовНаряду с проблемой детектирования массивных биоорганическихобъектов определению аддуктов с эстеразами препятствует и низкаяконцентрация определяемого вещества в матрице, содержащей большоеколичество схожих по физическим и химическим свойствам агентов.Решением в масс-спектрометрическом определении аддуктов являетсяселективное обогащение биологических образцов до уровней, когдаколичество ингибированной эстеразы достигнет порога обнаружения.Первичное обогащение проводится на прокаинамид-сефарозе в ходеаффинной хроматографии, принято для работы с бутирилхолинэстеразой[49][50], однако чистота полученного субстрата требует дополнительнойстадии очистки методами гелевого электрофореза или селективной сорбции пофосфорорганическому сайту, что добавляет сложности к анализу и приводитк неизбежным потерям вещества.
Предложен метод одностадийной очисткиобразцов бутирилхолинэстеразы моноклональными антителами [25], однаковвиду чрезвычайно высокой цены этот метод вряд ли получит широкоераспространение. Такой же подход применим и для предварительноговыделения АХЭ.1.5.Сорбционная очистка и концентрированиеНизкиеконцентрацииопределяемыхвеществ,малыйдиапазондопустимых температур, сложный состав и высокая молекулярная массанаряду с достаточно высокой химической активностью приводят к тому, чтоединственным доступным методом разделения и концентрирования аддуктовбелков с ФОВ остается адсорбция.1.5.1. Металл-аффинные сорбентыСуществует два главных подхода к металл-аффинной сорбции:1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
