Автореферат (Экспрессия генов транскрипционных факторов LXRalpha, LXRbeta, PPARgamma и транспортера ABCA1 при атеросклерозе), страница 2

Данные, представленные в диссертации, опубликованыв виде четырех статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.Материалы работы также были представлены на международных и российскихконференциях: Европейской конференции по генетике человека (Барселона,Испания, 2008), Международной конференции «Биология: от молекулы добиосферы» (Харьков, Украина, 2008), V съезде Вавиловского обществагенетиков и селекционеров (Москва, 2009), III конгрессе FEBS “ABC Proteins”(Инсбрук, Австрия, 2010), 4-й Международной конференции молодых ученыхИМБ «Молекулярная биология: проблемы и перспективы» (Киев, Украина,2011), Российском национальном конгрессе кардиологов (Санкт-Петербург,2013), Европейском конгрессе общества атеросклероза (EAS) (Гамбург,Германия, 2010; Милан, Италия, 2012; Мадрид, Испания, 2014).Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит изследующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методыисследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы и списоклитературы, включающий 195 источников. Работа изложена на 116 страницах,содержит 22 рисунка и фотографии, 5 таблиц.СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫМатериалы и методы исследованияХарактеристика обследованных группДля оценки вклада вариантов (–17)G > C (SNP ID rs2740483), 319ins < G(SNP ID rs1799777), R219K (G655A) (SNP ID rs2230806) гена АВСА1 в развитиеатеросклероза была отобрана группа пациентов, которая состояла из119 человек (79 % мужчин и 21 % женщин) с атеросклерозом, подтвержденнымангиографическим исследованием (средний возраст – 51,41 ± 6,21 года).7Первые клинические проявления атеросклероза у пациентов наблюдалисьв возрасте 47,87 ± 7,05 года. Локализация пораженных атеросклерозом артерийбыла обнаружена как минимум в одном из трех артериальных бассейнов(церебральном, коронарном или бассейне артерий нижних конечностей).Контрольная группа состояла из 300 человек (63 % мужчин и 37 % женщин)без ССЗ в анамнезе и соответствовала группе пациентов по полу и возрасту(средний возраст 45,60 ± 6,30 года).

Возраст контрольной группысоответствовал возрасту начала заболевания у пациентов.Для оценки вклада уровня мРНК генов ABCА1, LXRα, LXRβ, PPARγ, MMP-9и уровня белка ABCА1 в развитие атеросклероза была отобрана группапациентов, которая состояла из 15 мужчин с атеросклерозом, подтвержденнымангиографическим исследованием (средний возраст – 53,87 ± 6,78 года).Первые клинические проявления атеросклероза у пациентов наблюдалисьв возрасте 47,73 ± 4,33 года. Пораженные атеросклерозом артериирасполагались в коронарном бассейне.

У всех больных был выявлен стенозболее 50 % как минимум в одной артерии коронарного бассейна.Контрольная группа состояла из 19 человек без ССЗ в анамнезеи соответствовала группе пациентов по полу и возрасту (средний возраст –52,05 ± 6,05 года).Все пациенты, вошедшие в выборки, не принимали ни статинов, ни какихлибо иных гиполипидемических средств. Все представители контрольныхгрупп проходили обследование врача-кардиолога. Данные выборки являютсяслучайными и принадлежат к тому же географическому региону, чтои включенная в анализ группа лиц, больных атеросклерозом.Методы исследованияДля получения макрофагов свежесобранную кровь смешивали в равномсоотношении с фосфатно-солевым буферным раствором (PBS).

Смесьнаслаивали на фиколл-верографин (р = 1,077, БиоЛот, Санкт-Петербург),центрифугировали (1 500 об/мин, 30 мин), мононуклеары промывали в PBS,центрифугировали (1 500 об/мин, 15 мин). Затем клетки ресуспендировалив культуральной среде (альфаMEM, 10 %-ная эмбриональная сыворотка,5 мкг/мл антибиотиков (пенициллин G, стрептомицин)) и инкубировалив СО 2 - инкубаторе в течение 2 ч. После чего прикрепившиеся к чашкам Петримоноциты культивировали в присутствии колониестимулирующего факторамакрофагов M-CSF 15 нг/мл (R&D Systems, США) в течение 5 сутокс ежедневной заменой питательной среды.

Далее моноциты и макрофаги былииспользованы для определения содержания мРНК ABCA1, LXRα, LXRß, PPARγи MMP-9 и белка ABCA1.8Для выделения тотальной мРНК и проведения реакции обратнойтранскрипции применяли наборы RNeasy Minikit (Qiagen, Германия) и cDNAsynthesis kit (Fermentas, Литва). Уровень мРНК генов ABCA1, LXRα, LXRß,PPARγ и MMP-9 определяли методом количественной ПЦР в режиме реальноговремени с флуоресцентными зондами TaqMan на приборе CFX96 Touch(BioRad, США). В качестве референсного гена был использован конститутивноэкспрессирующийся в клетках ген β-актина.Содержание белка ABCA1 в макрофагах оценивали методом вестернблоттинга с использованием первичных кроличьих антител к ABCA1 (1 : 1 000;ab7360, Abcam, Великобритания).

Результаты нормировали относительноокрашивания β-актина (1 : 10 000; ab8227, Abcam, Великобритания). Клеткилизировали, количество общего белка определяли по методу Бредфордас использованием реагентов фирмы «Силекс» (Россия) на спектрофотометреSmartSpecTMPlus (Bio-Rad, США). В экспериментах использовали вторичныеантикроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (1 : 3 000;ab6721,Abcam,Великобритания).РезультатыидентифицировалиTMс использованием набора Amersham ECLPlus System (Amersham,Великобритания) и фотопленки CEA (Швеция).Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови методомфенольно-хлороформной экстракции. Идентификацию вариантов (–17)G > C,319ins < G, R219K гена АВСА1 проводили методом ПЦР с последующимрестрикционным анализом, как описано ранее (Zwarts et al., 2002).Концентрацию общего ХС и ХС в составе ЛПВП (Х-ЛПВП) в плазме кровиизмеряли на автоанализаторе А-15 (BioSystems, Испания) с использованиемнаборов фирмы BioSystems.Статистический анализ был проведен с использованием программыStatistica 6.0.

Для качественных данных определяли частоты встречаемости в %.Проверку соответствия полученного распределения генотипов равновесиюХарди – Вайнбергаосуществлялиприпомощинепараметрическогокритерия χ2. Соответствие полученных данных нормальному распределениюпроверялось с помощью критериев Шапиро – Уилка или Колмогорова –Смирнова в зависимости от размера выборки. Для сравнения количественныхданных использовали метод дисперсионного анализа ANOVA для несколькихгрупп и непараметрический метод U-теста Манна – Уитни. Значения p < 0,05считались статистически значимыми.

Для определения относительного рискаиспользовали показатель соотношения шансов (odds ratio, OR),рассчитываемый по формуле9OR=a×d,b×cгде a – количество пациентов, имеющих более редкую аллель; b – количествопациентов, не имеющих более редкую аллель; c – количество индивидуумов изконтрольной группы, имеющих более редкую аллель; d – количествоиндивидуумов из контрольной группы, не имеющих более редкую аллель. Дляопределения корреляции между количественными характеристикамипользовались корреляционным анализом по Спирмену.

Коэффициенткорреляции r > 0,5 при р < 0,05 означал положительную и статистическизначимую корреляцию между признаками, а отрицательное значение rсоответствовало обратной корреляции. В тексте диссертации и в таблицахсредние величины приведены в виде среднего значения ± стандартноеотклонение. В случае достоверных различий дополнительно приведенызначения медианы (минимум – максимум).Результаты и обсуждениеАнализ вклада вариантов гена АВСА1 (R219K, 319ins < G, (–17)G > C)в развитие атеросклерозаЧастоты вариантов гена АВСА1 (R219K (G655A), 319ins < G, (–17)G > C)в группе больных с атеросклерозом и в контрольной группе представлены втабл.

1. В исследуемых группах распределение генотипов гена ABCA1находилось в соответствии с распределением Харди – Вайнберга.В исследовании показано, что в контрольной группе частоты вариантов генаАВСА1 (R219K, 319ins < G, (–17)G > C) были сопоставимы со значениями,полученными в европейских популяциях (Zwarts et al., 2002; Jensen et al., 2007;Ma et al., 2011).Различий в частотах вариантов R219K и (–17)G > C гена АВСА1 междугруппой пациентов с атеросклерозом и контрольной группой обнаружено небыло (табл.

1).В группе пациентов с атеросклерозом наблюдалось достоверное снижениечастоты варианта G319 гена АВСА1 по сравнению с контрольной группой(15,1 % и 25,4 % соответственно, р = 0,03, df = 1). Был установлен пониженныйотносительный риск развития атеросклероза у носителей варианта G319 генаАВСА1 по сравнению с лицами, у которых отсутствует вставка нуклеотида Gв 319 положении гена АВСА1 (OR = 0,55 (95 % ДИ: 0,86–0,35)).10Таблица 1Частоты вариантов гена АВСА1 в группе пациентов с атеросклерозоми в контрольной группеВарианты гена АВСА1R219KRRRKKKf (R аллель)f (К аллель)(–17)G > CCCCGGGf (G аллель)f (С аллель)InsG319NNNG + GGf (N аллель)f (G аллель)Частота аллелей n, %группа пациентовконтрольная группас атеросклерозом60(50,4)52(43,7)7(5,9)150(50,0)131(43,7)19(6,3)0,720,280,720,2868(57,1)44(37,0)7(5,9)156(52,0)131(43,7)13(4,3)0,760,240,740,26101(84,9)18(15,1)*0,930,07224(74,6)75 + 1(25,4)0,870,13* p < 0,05, OR (NG + GG vs NN) = 0,55 (95 % ДИ: 0,35–0,86).Ранее в исследовании Zwarts с соавт.

было показано, что носительствоаллели G в положении 319 гена АВСА1 ассоциировано со снижениемлокального и диффузного атеросклероза по сравнению с вариантом, когдааллель G в положении 319 отсутствовала (Zwarts et al., 2002). Однакомеханизмы, объясняющие функциональный эффект этого варианта на развитиеи прогрессирование атеросклероза, остаются в настоящее время неизученными.Поскольку вариант 319insG расположен в 5`-нетранслируемой области генаАВСА1, возможно предположить, что вставка нуклеотида G в 319 положениигена АВСА1 может затрагивать регуляторные элементы, отвечающие застабильность мРНК гена АВСА1.11Уровень мРНК генов ABCА1, LXRα, LXRβ, PPARγ и MMP-9 и уровня белкаABCА1 в макрофагах, активированных М-CSF, исследуемых группВ настоящем исследовании для измерения уровня мРНК ABCA1, LXRα,LXRβ, PPARγ и MMP-9 был создан банк макрофагов, активированных факторомM-CSF.Было показано, что в макрофагах пациентов с атеросклерозом уровеньмРНК ABCA1 (медиана 1.60 (мин.

– макс. 0,83–2,73)) повышен по сравнениюс макрофагами лиц контрольной группы (медиана 0,66 (мин. – макс. 0,15–1,66))(p < 0,001) (рис. 1).Рис. 1. Относительный уровень мРНК генаABCA1 в макрофагах у пациентовс атеросклерозом (N = 15) и в контрольнойгруппе (N = 19), * – p < 0,001. Ось абсцисс –исследуемые группы; ось ординат –относительный уровень мРНК (отн. ед.)Повышение уровня мРНК гена ABCA1 указывает на измененнуюэкспрессию гена АВСА1 и, соответственно, может модифицироватьэффективность ОТХ и влиять на темпы атерогенеза.