Диссертация (Разработка состава и технологии лекарственных форм с экстрактами эвкалипта прутовидного (eucalyptus viminalis labill.) и эхинацеи пурпурной (Echinacea purpurea Moench) для лечения воспалительных заболеваний полости рта), страница 7

Для удаления с него лакового покрытия –вымачивали предварительно в воде очищенной в течение 30 мин.В химический стакан емкость 100 мл наливали 30 мл воды очищенной.10,0 г испытуемой ЛФ помещали внутрь трубки на зафиксированныйцеллофан и опускали в стакан на поверхность воды очищенной (погружениетрубки с исследуемым образцом – не более 2 мм). Затем трубки с исследуемымиобразцами вместе с химическими стаканами термостатировали при 37оС±1оС.В течение 3 часов проводили забор проб в количестве 5 мл через 15; 30; 45;60; 90; 120 и 180 минут. После забора 5 мл диализной жидкости из химическогостакана – объем сразу же восполняли водой очищенной.

О высвобождении БАВиз ЛФ судили по их концентрации в пробе.По полученным результатам строили графики изменения концентрациираствора во времени. Параллельно измеряли оптическую плотность диализнойжидкости из ЛФ, не содержащих активных компонентов (плацебо).422.2.3. Исследование специфической активности лекарственных форм вопытах in vitroМикробиологические методыИзучение бактериостатической и фунгистатической активности в опытах invitroАнтимикробное действие выбранных объектов изучали в опытах in vitroметодомдвукратныхсерийныхразведенийсубстанциипрепаратавсоответствующих каждому микроорганизму жидких питательных средах приоптимальных для каждого вида микроорганизмов условиях опыта (t°С,длительность), а также методом диффузии в агар (метод "агаровых пластин").Метод двукратных серийных разведенийДля изучения бактериостатической активности в качестве питательнойсреды использовали мясо-пептонный бульон (МПБ), а для фунгистатическойактивности – питательную среду Сабуро.

Антибактериальный и антифунгальныйэффект определяли по минимальной ингибирующей рост микроорганизмовконцентрации (МИК) в мкг/мл, при которой визуально не наблюдали ростамикроорганизмов [23].Вкачестветест-микроорганизмовиспользовалиграмположительные кокки Staphylococcus aureusАТССпатогенные6538 (209-P),грамотрицательные бактерии Escherichia coli ATCC 25922, Proteus vulgaris ATCC6896 и Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027, дрожжеподобные грибы Candidaalbicans АТСС 10231 и мицелиальные грибы Microsporum canis 3/84.Приопределении бактериостатической активности веществ использовали мясопептонный бульон (МПБ).Фунгистатическую активность в опытах in vitro изучали методомдвукратных серийных разведений препаратов в жидкой питательной средеСабуро.

Посевы инкубировали при температуре 30-320С: дрожжеподобные грибы43– в течение 48 часов, мицелиальные грибы − в течение 10-14 суток. Опытыпроводили в трех повторностях.Бактериостатическую и фунгистатическую активность определяли поминимальной, подавляющей рост бактерий и грибов, концентрации препарата.Метод диффузии в агар (метод "агаровых пластин")Вкачестветест-микроорганизмовграмположительные коккиStaphylococcusиспользовалиaureusпатогенныеАТСС 6538 (209-P) идрожжеподобные грибы Candida albicans АТСС 10231.При определении бактериостатической активности лекарственных формиспользовали среду № 1 ГРМ, фунгистатической активности – агар Сабуро.Растопленный на водяной бане и охлажденный до 45°С питательный агар вколичестве 100 мл смешивали с 1 мл взвеси тест-микроорганизма, содержащей108 микробных тел/мл по стандарту мутности ОСО 42-28-85-2014 (10 МЕ) иразливали в чашки Петри по 20 мл.

Далее таблетки помещали на поверхностьзастывшего агара. Чашки Петри в течение 1 часа выдерживали при комнатнойтемпературе для того, чтобы действующие вещества из лекарственной формыдиффундировали в агар, после чего чашки инкубировали в термостате 24 часа притемпературе 37°С (для бактерий) и 72 часа при температуре 30-32°С (для грибов).Результаты оценивали по величине зоны задержки роста микроорганизмов,определяя величину зон путем измерения расстояния в мм от края тест-образца(от края таблетки) до границы роста микроорганизмов вокруг теста.Антимикробную активность жидкой лекарственной формы, содержащейэвкалимин и эстифан, изучали методом диффузии в агар в 2-х вариантах:1) нанесением жидких растворов непосредственно на поверхность застывшегоагара; 2) методом «лунок».Растопленный на водяной бане и охлажденный до 45°С питательный агар вколичестве 100 мл смешивали с 1 мл взвеси тест-микроорганизма, содержащей108 микробных тел/мл по стандарту мутности ОСО 42-28-85-2014 (10 МЕ) иразливали в чашки Петри по 20 мл.

Исследуемые растворы наливали на44поверхность застывшего агара, растирали стерильным шпателем, равномернораспределяя слой образца по поверхности агара. Для 2 варианта методики в агаределали лунки диаметром 1,0 см с помощью металлического цилиндра изнержавеющей стали и заполняли их образцами исследуемых растворов.

ЧашкиПетри в течение 1 часа выдерживали при комнатной температуре для того, чтобыдействующие вещества из лекарственной формы диффундировали в агар, послечего чашки инкубировали в термостате 24 часа при температуре 37°С (длябактерий) или72 часа при температуре 30-32°С (для грибов). Результатыоценивали по величине зоны задержки роста микроорганизмов, определяявеличину зон путем измерения расстояния в мм от края лунки до границы ростамикроорганизмов вокруг теста.Благодарим зав. лабораторией микробиологических исследований ФГБНУ ВИЛАРФатееву Т.В. за помощь и содействие при проведении исследований.Исследование противовоспалительной активности ЛФ в опытах in vitroПротивовоспалительную активность изучали на 60% водно-спиртовыхрастворах фитоэкстрактов эвкалипта прутовидного (эвкалимин), эхинацеипурпурной(эстифан)и их фармацевтической композиции, приготовленнойвсоотношении 1:1.

Исследовали в концентрации 2 мг/мл, 1мг/мл и 0,2 мг/мл.В работе использовали препарат индуцибельной NO-синтазы (iNOS),полученный из мышиных макрофагов, экспрессированных E. сoli, в буферномрастворе 50 мМ HEPES («Sigma-Aldrich», США) с pH 7,4 , содержащем 1мМацетатмагнияи10%глицерина.Скоростьферментативнойреакции,катализируемую iNOS, определяли кинетическим методом по изменениюоптической плотности НАДФН при 340 нм на двулучевом спектрофотометремарки «Shimadzu UV1800» (Япония) при температуре 370С [13, 14].Ферментативную реакцию в условиях in vitro активизировали 0,15 мМраствором НАДФН.

Скорость ферментативной реакции, катализируемой iNOS,определяли до (контроль) и после (опыт) добавления в реакционную среду 20 мклтестируемых растворов.45Полученные результаты обрабатывали статистически.Выражаем благодарность внс ФГБНУ ВИЛАР, канд. биолог. наукСтрелковой Л.Б. за помощь и содействие при проведении экспериментальныхисследований.Изучение иммуностимулирующей активности ЛФ с применениемспецифических ферментных биотест-систем in vitroИммуностимулирующую активность БАВ определяли по влиянию наактивность НАДФН-оксидазы in vitro [58]. НАДФН-оксидазный тест in vitroпроводили при измерении скорости НАДФН оксидазной реакции в гомогенатахсвежих клеток полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПМЛ) макрофагов в плацебо –объекте и в присутствии исследуемого образца.

Источником НАДФН-оксидазы,тирозингидроксилазы служил гомогенат клеток крови кроликов. Гомогенатготовили в лабораторном пестиковом гомогенизаторе Поттера-Элвегейма (США)с зазором 10 мкм, которыйпомещали на лед и растирали клетки крови(лейкоциты кролика) в течение 2-3 мин. Затем гомогенат центрифугировали при40С, со скоростью 9000 об/мин, в течение 15 мин. Полученный гомогенатпереносили в пробирку Эппендорфа. Готовили 65mM Na, K-фосфатный буфер,который хранили при температуре +20С не более 3 суток. Объем исследуемыхобразцов составил 0,5 мл.

Скорость реакции измеряли спектрофотометрически наанализаторе для клинической химии Clima МС-15 по уменьшению оптическойплотности раствора при длине волны 340 нм. Во время опыта все растворынаходились в емкости со льдом. Полученные результаты статистическиобрабатывали. Рассчитывалисреднюю арифметическую величину и ошибкусредней арифметической (М±m). Достоверность различия между выборкамиопределяли по критерию Стьюдента (t-критерий). Различия между выборкамисчитались значимыми при р<0,05.Благодарим снс ФГБНУ ВИЛАР, канд.

биолог.наук Лупанову И.А. за помощьи содействие при проведении исследования.462.2.4. Математические методыМетод обобщѐнной функции желательности ХаррингтонаДля выбора оптимального состава применили математическую функциюжелательности Харрингтона [43, 65], которая позволяет проводить оптимизациюпараметров объекта по стандартной шкале желательности Харрингтона.

Методвключает расчеты значений частных наиболее значимых показателейжелательности отдельных свойств (d) и обобщѐнной функции желательности (D)этих показателей. Значение D=0 соответствует «абсолютно неприемлемомууровню данного свойства (очень плохое качество), а D=1 соответствует самомулучшему значению свойства (очень хорошее качество)» [65]. По откликам,преобразованных в шкалу d, рассчитывали обобщенную функцию желательностикак среднее геометрическое частных функций отдельных свойств.Статистическуюобработкурезультатовпроводилиспомощьюпрограммы Statistica MSExsel, Origin Pro 7.5 [71].Выводы по главе II1. Для разработки и изучения лекарственных форм антимикробного,противовоспалительного и иммуностимулирующего действия в качествеактивных фармацевтических субстанций выбраны экстракты эвкалиптапрутовидного и эхинацеи пурпурной.2.

Вспомогательные вещества для лекарственных форм представлены различнымиингредиентами, разрешенными для использования в фармацевтическойтехнологии.3. В работе использованы современные методики анализа, позволяющиевсесторонне изучить новые комбинированные составы лекарственных форм дляоказания антимикробного, противовоспалительного и иммуностимулирующегодействия.47Глава III. Разработка комбинированного состава и технологии спрея срастительными экстрактами эвкалипта прутовидного и эхинацеи пурпурнойДо недавнего времени в медицине доминировало представление онеприемлемости использования комбинаций различных действующих веществ втерапии того или иного заболевания.