Автореферат (Сравнительный анализ клинического течения и микробного пейзажа у больных с различными формами рожи), страница 3

(сут.)7,89  0,448,31  0,777,71  0,60Буллы:появление, д.б.3,14  0,333,6  0,343,55  0,41Остаточные явления:Застойная гиперемия66,7 % *25,0% #28,6 %Отек18,5 % *12,5 % *64,3%Инфильтрат0%18,8 %14,3 %Корки55,6%18,8% * #78,6%Затяжн. репарация,25,9% *43,8%7,1%трофич. язвы, раны* -достоверность отличий в сравнении с 3 подгр.; # - с 1 подгр.(р  0,05)либо бактериологическим методом, либо ПЦР) (р  0,01). В подгруппе, гдестафилококки не были выявлены ни одним из методов, эритематозные ибуллезно-геморрагические формы рожи встречались с одинаковой частотой,причем буллезно-геморрагические формы – достоверно реже, чем в 1 и 2подгруппах. Первичная рожи преобладала над повторной во всех подгруппах,однако, рецидивирующая рожа отмечена только у больных с обнаружениемстафилококков.Достоверно более выраженная лихорадочная реакция, как один изпоказателей интоксикационного синдрома, была отмечена у больных именнопри высеве стафилококков (1 подгруппа), что свидетельствовало о важностиприсутствии жизнеспособных микроорганизмов, обладающих возможностью15продуцировать токсины, в сравнении с 2 и 3 подгруппами.

Также в 1 подгруппеотмечено достоверно более раннее начало развития эритемы.Из остаточных явлений при обнаружении стафилококков бактериологическим методом отмечено достоверно большее число больных с застойнойгиперемией в области очага, и в 3 раза больше случаев с затяжной репарациейочага, трофическими язвами и сохраняющимися ранами к моменту выпискибольных из стационара, чем в подгруппе 3 - без выявления стафилококков.Нами впервые было установлено, что в присутствии культивируемыхS.aureus на поверхности кожи непосредственно в очаге определяетсязначительное число ДНК стафилококков и стрептококков (в 83,87% проб),что достоверно превышает частоту выявления ДНК микроорганизмов в очаге(47,06%) при высеве с поверхности очага других видов стафилококков (впервую очередь, считающихся сапрофитными S.epidermidis и S.saprophyticus), атакже у больных без высева микроорганизмов (47,69%) с поверхности кожи.В связи с этим, мы провели анализ особенностей клинико-лабораторныхпоказателей вгруппах больных с присутствием на коже в области очагаотдельных стафилококков - S.aureus или S.epidermidis и/или S.saprophyticus,либо без высева стафилококков.Установлено, что присутствие культивируемых S.aureus на поверхностикожи очага сопровождается более высокой лихорадкой и лейкоцитозом,ускорением СОЭ, повышением лейкоцитарного индекса интоксикации, числапалочкоядерных лейкоцитов, щелочной фосфатазы и мочевины в крови,снижением числа лимфоцитов, большим количеством эритроцитов в моче, чему больных с отсутствием высева S.aureus с поверхности очага или с высевомдругих стафилококков.

Это свидетельствует о том, чтоS.aureus усиливаетобщеинтоксикационный синдром и воспалительные реакции в организмебольныхрожейнижнихконечностей,чтоотражаетсянаизменениисоответствующих показателей. Иная картина наблюдается при анализеклинико-лабораторных показателей в группах больных рожей в зависимости отвыявления ДНК S.aureus в очаге методом ПЦР: различий не выявлено.16Анализ ультратонких срезов посевов мазков из раны и содержимого буллв области местного воспалительного очага у больных рожей показал, что в рядеслучаев одновременно определялись микроорганизмы морфологически разныхгрупп грамположительных бактерий - стафилококки и стрептококки.

МетодомСЭМ в нативных препаратах содержимого экссудата булл были обнаруженыокруженные аморфным веществом кокковидные бактерии и кристаллы соли, поморфологии идентичные кристаллам NaCl (Рис. 3А), что было подтверждено вэнергодисперсионном химическом анализе. После инкубации содержимогобулл с полиэтиленгликолем при просмотре препаратов было выявлено большоеколичество кокковидных бактерий.

По морфологическим характеристикамгруппы кокков отличались друг от друга: первая группа более крупных клеток(более 1 мкм) при делении образовывала тетракокки, другая группа былапредставлена более мелкими клетками (500-700 нм), характер деления которыхсоответствовал стафилококкам, а также сопоставимые по размерам кокки, ноформирующие цепочки, характерные для стрептококков. (Рис. 3Б). Кроме этогообнаруживалисьи палочковидные бактерии, покрытые экзополиматриксом(Рис.3В). В контрольном препарате полиэтиленгликоля контаминирующиебактерии обнаружены не были (Рис.3Г).Методом ТЭМ в препарате ультратонких срезов циркулирующихиммунных комплексов были обнаружены кокковидные бактерии разнойстепени сохранности – от бактерий, идентичных по строению вегетативнымформам кокков, причем в стадии деления, до лизированных клеток, полностьюутратившихклеточнуюстенкусразрушеннымрибонуклеопротеиднымкомплексом (Рисунок 4).Кроме этого в препаратах циркулирующих иммунных комплексов, вкоторых обнаруживались кокки, были выявлены вирусоподобные частицы(Рисунок 5).

Эти частицы локализовались вне бактериальных клеток и внутрилизированных бактерий. Локализация частиц, их размеры (50 - 60 нм), характервызываемых ими повреждений бактерий (лизис цитоплазмы, рибонуклеопро17теидного комплекса, разрыв клеточной стенки) позволяет считать эти частицыфагами. Фаговые частицы также были обнаружены в бактериях (кокках) припервом пассаже культур на питательных средах из содержимого булл и мазкахизочагавоспаления.Впервомпассажеподавляющеебольшинствобактериальных клеток можно было охарактеризовать как лизированные, исреди них встречались группы сохранных вегетативных клеток с толстойклеточной стенкой, плотной цитоплазмой, резистентных к циркулирующему вбактериальной культуре фагу (Рисунок 6).При исследовании методом СЭМ в очагах воспаления бактерииформировали смешанные биопленки – совокупность бактерий, окруженныхмассивным слоем экстацеллюлярного матрикса (Рис.

7,8).Одновременное выявление в препаратах из очага местного воспалениястафилококков и стрептококков подтверждает данные бактериологическогоисследования и ПЦР о микст-инфекции у больных рожей. Обнаружение приТЭМ полуразрушенных лизированных бактерий и внутриклеточных фаговыхчастиц объясняет отсутствие высевов микробов при наличии их ДНК в очаге.В - палочковидные бактерииА - бактерии, покрытые Б -тетракоккиГ - контаминация ПЭГаморфным веществом эк- стафилококкимикробами не выявленассудата, кристаллы NaClРис. 3. Экссудат (содержимое буллы) (СЭМ): А - нативный препарат экссудата;Б - инкубированный с ПЭГ (60 кDa) в течение 12 час при +4оС;В - палочковидные бактерии; Г – препарат ПЭГ (60 кDa) (контроль)18Кокковидныебактериивсоставе ЦИКДелящиеся бактерииЛизированная бактерияРис.

4. Препарат циркулирующего иммунного комплекса (ТЭМ)Лизированные бактерииФаговые частицыФаговыечастицыРисунок 5. Вирусоподобные (фаговые) частицы внутри лизированныхбактерий (кокков) и вне бактериальных клеток (ТЭМ)Фагорезистентные бактерииРис. 6. Первый пассаж культуры (мазок из очага воспаления) (ТЭМ)19БактерииЗрелая биопленкаЭкстрацеллюлярныйматриксРис.

7. Формирование зрелой биопленки с хорошо выраженнымэкстрацеллюлярным матриксом в очаге воспаления. Эктрацеллюлярныйматрикс. Бактерии (СЭМ)Впервые методом сканирующей электронной микроскопии в областиместного воспалительного очага были обнаружены биопленки, присутствиекоторых свидетельствует о высокой пленкообразующей способности бактерийу больных рожей (стафилококков, стрептококков и других), что обусловливаетизвестные трудности антибиотикотерапии у этих больныхПри исследовании методом СЭМ содержимого буллы у больных ссопутствующим заболеванием – микоз стоп, помимо кокковидных бактерийбыли обнаружены более крупные микроорганизмыразмеромдо 1,5 мкм,возможно споры грибов.

Там же были обнаружены смешанные бактериальныеСмешанные биопленки свключениями грибковыхмикроорганизмовБактериальные биопленки20БактерииРис. 8. Биопленки в мазке-отпечатке из очага (СЭМ)биопленки,однимизкомпонентовкоторыхбылигрибы(вслучаесопутствующей микотической инфекции).Среди микроорганизмов у больных рожей в области местноговоспалительного очага методом ТЭМ преимущественно были определеныстафилококки и стрептококки, споры и гифы грибов в ассоциации, в том числе,отмечено формирование биопленок в очаге с участием вышеперечисленныхмикроорганизмов и внеклеточного матриска.Данные, полученные при электронной микроскопии, расширяют нашипредставленияосоставе,состояниииструктурнойорганизациимикроорганизмов, присутствующих в очаге местного воспаления и в крови убольных рожей, соответствуют и объясняют совокупность данных, полученныхприизучениимикробногопейзажаместноговоспалительногоочагабактериологическим методом и ПЦР с гибридизационно-флуоресцентнойдетекцией в реальном времени.Таким образом, в результате впервые проведенного нами комплексногоисследования микробного пейзажа у госпитализированных больных рожей сиспользованием бактериологического, молекулярно-генетического методов,сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии было установлено,что, наряду с β-гемолитическим стрептококком группы А в очаге воспаленияпри буллезно-геморрагической форме рожи присутствуют другие виды21патогенныхбактерий.Очевидно,формированиевочагевоспалениясмешанного микробиоценоза и биопленок является причиной более тяжелоготечениязаболеванияиоднойизпричинсниженияэффективностиантибактериальной терапии.Выводы1.

Микробный пейзаж в области местного воспалительного очага взначительнойстепениопределяетособенностиклиническойкартинызаболевания у больных рожей - выраженность общей интоксикации ивоспаления в области местного воспалительного очага, скорость репарации ивозникновение осложнений.2. В структуре выявляемых у больных рожей культивируемых микроорганизмов ведущее место занимают стафилококки - 63,27% (S.aureus,S..epidermidis и S.saprophyticus),затем - стрептококки, до 9% (S.pyogenes,S.pneumoniae и S.dysgalactiae подтип equisimilis), остальные микроорганизмывыявляются в единичных случаях.3.Выявление бактериологическим методом S.aureus в смывах споверхности кожи местного воспалительного очага, в основном, при буллезногеморрагическойроже,сопровождаетсявыраженнойинтоксикацией,воспалением и высокой частотой обнаружения ДНК бактерий методом ПЦРв тканях очага.4.

Среди стафилококков, выявляемых в области местного воспалительногоочага, присутствуют, наряду с MSSA, также MRSA и MRCoNS штаммы, чтообусловливает более тяжелое течение заболевания и трудностивыбораантибактериального препарата5. Полимеразная цепная реакция с гибридизационно-флюоресцентной детекцией в режиме реального времени более информативна в выявлении S.pyogenesв тканях воспалительного очага, чем бактериологическое исследование.6.Врезультатетрансмиссионнойисследованияэлектроннойсприменениеммикроскопиясканирующейпунктатов в областииочага,буллах и крови выявлены группы бактерий (кокки, палочки, грибы), как в22монокультуре,такэкстрацеллюлярнымивсочетанииматриксом,что(микст-инфекции),свидетельствуетопокрытыеформированиибиопленок.7.

В настоящее время среди госпитализированных больных рожейпреобладают женщины, лица старших возрастных групп, с преимущественнымрасположением очага на коже нижних конечностей с геморрагическимипроявлениямиПрактические рекомендации. В целом, одновременное использованиебактериологического метода и ПЦР с гибридизационно-флюоресцентнойдетекцией в режиме реального времени позволяет оценить микробный пейзажочага, выявить сочетанноеприсутствие микробови иххарактеристики,объективно оценить выраженность интоксикационного синдрома и даетвозможность целенаправленной коррекции антибактериальной терапии взависимости от выявляемых микроорганизмов и их свойств.Наоснованиигоспитализированныхполученныхбольныхрезультатоврожейсовременного бактериологическогоболееможнорекомендоватьширокоеуиспользованиеисследования, при этом выявление наповерхности кожи в области местного воспалительного очага золотистогостафилококка может расцениваться в качестве показателя значительногообсеменения тканей очага, в первую очередь стафилококками, а такжедругими микроорганизмами, что может привести к замедлению репарациитканейв очаге, возникновениюосложнений и остаточных явлений.