Диссертация (Диагностическое значение анализа матриксных металлопротеиназ у детей с расщелиной губы и неба), страница 7

в переносном холодильникеРисунок 9 – Частотные распределения по величине белка из зоны без патологииДля иммуноферментного анализа использованы реактивы ведущих мировыхпроизводителей такие как: HumanТИМП-2 QuantikineELISAKit - RnDSystems,HumanММП-2 QuantikineELISAKit - RnDSystems,Bio-PlexProTGF-β Panel, 3-PlexBio-RadLaboratories, AESKULISAММП3, (Рисунок 10).

Принцип методазаключался в следующем и был аналогичным для ММП3, ММП2, ТИМП2,TGFβ2.39Рисунок 10 – Набор для иммуноферментного анализа.Антитела специфичные к ММП3, ММП2, ТИМП2, TGFβ2 сорбированы вячейках планшета. ММП3, ММП2, ТИМП2, TGFβ2 образцов, стандартов иконтрольных образцов связывается с антителами в ячейках планшета. ММП3,ММП2, ТИМП2, TGFβ2 образцов, стандартов и контрольных образцовсвязывается с антителами в ячейках планшета.

Добавляемый конъюгатбиотинмоноклональныеанти-ММП3,ММП2,ТИМП2,TGFβ2антителасвязывают ММП3, ММП2, ТИМП2, TGFβ2, захваченный первыми антителами.После инкубации и промывки планшета из ячеек удаляется не связавшийсябиотиновый конъюгат, и в ячейке добавляется конъюгат стрептавидинпероксидаза, связывающий биотин, конъюгированный с ММП3, ММП2, ТИМП2,TGFβ2.Рисунок 11 – Аппарат для промывки планшетаПромывка осуществляется аппаратом фирмы BIO-RAD.

После инкубации ипромывки (Рисунок 11) из ячеек удаляется не связавшийся стрептавидиновыйконъюгат, ячейки добавляется субстратный раствор, который взаимодействует с40Рисунок 12 – График частотного распределения по величине ММП2 и ММП3ферментным комплексом с образованием окрашенного раствора.Реакцияостанавливается добавлением кислоты. Интенсивность окраски, измеренная надлине волны 450 нм, прямо пропорциональна концентрации ММП3, ММП2,ТИМП2, TGFβ2, присутствующего в образцах. Концентрация ММП3, ММП2,ТИМП2, TGFβ2 в образцах определяется по стандартной кривой, построенной по6 приготовленным разведениям стандарта.Рисунок 13 – Графики частотного распределения по величине ТИМП2 и TGFβ2.Постройка кривой осуществлялась программным обеспечением, входящим вкомплект к спектрофотометру фирмы BIO-RAD (Рисунок 14).41Рисунок 14 – Спектрофотометр.Полученные результаты представлены в приложении 2.

На рисунках 8,9,12 и 13представлено распределение полученных результатов в ходе иммуноферментногоанализа ММП2, ММП3, ТИМП2, TGFβ2, а также содержание белка в образцах.2.3 Статистическая обработка полученных результатов.Статистический анализ фактических данных проводился с использованиемпрограммы IBM SPSS Statistics 21.0.

Доверительные границы для частотырассчитывалисьнаосновебиномиальногораспределения.Достоверностьразличия частот определялась при помощи критерия «хи-квадрат», для таблиц 2на 2 – в точном решении Фишера. Для числовых показателей рассчитывалисреднее арифметическое M, среднеквадратичное отклонение , статистическуюпогрешность среднего m, медиану Me, а также минимум, максимум и квартили.Достоверность различия среднего между группами определяли при помощидисперсионного анализа, связь между числовыми показателями искали припомощикорреляцииПирсона.Длябольшейпоказательностидлярядабиохимических показателей наряду с их исходными значениями использовалилогарифм значений.Ввидунекомпактностираспределениярядапоказателейтакжеиспользовали методы непараметрической статистики» критерии КолмогороваСмирнова и Манн-Уитни и коэффициент ранговой корреляции Спирмена.Различия считали статистически достоверными (статистически значимыми) приp<0,05.42ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ3.1.

Общая характеристика пациентов с расщелиной губы и небаКлиническое обследование и сбор материала для иммуноферментногоанализа на содержание ММП2, ММП3, ТИМП2, TGFβ2 осуществлялся в НаучномЦентре Здоровья Детей, г. Москвы, у пациентов, поступивших с 2013 до 2016года.Для оценки вида, типа и формы расщелины губы и неба, у пациентов припроведении первичной хейлопластики и уранопластики, нами использована вклинике классификация Ад. Мамедова (1998).В исследовании приняли участие с согласия родителей или представителейпациенты с расщелиной губы, расщелина губы и неба односторонняя, расщелинагубы и неба двусторонняя, расщелина неба частичная.Возраст пациентов составил от 3 дней до 9 лет на момент операции.Распределение пациентов по возрасту представлено в таблице 2.Пациенты для исследования подбирались без ограничений по полу ивозрасту, по весу, по типу родов и вскармливанию, и сопутствующей патологии.Всего приняли участие в исследовании 84 пациента из них девочек 35 (41,7% ДИ:32,1% - 51,7%), мальчиков 49(58,3% ДИ: 48,3% - 67,9%), то есть преобладаниеколичества мальчиков статистически недостоверно.

Из 84 пациентов расщелинагубы была у 64 пациентов, расщелина неба была у 75 пациентов в том числеодносторонняя у 34, двусторонняя у 35, и частичная расщелина губы у 7.Расщелина губы и неба наблюдалась у 57 (68%) пациентов из 84. Расщелина губы,у 8 пациентов (7%). Распределение пациентов представлено в таблице 3.В исследовании приняли участие дети, родившиеся в срок - 53 (63%) ипреждевременно - 31 (27%) в том числе кесарево сечение 8(10%). Всем пациентамбыло проведено оперативное вмешательство – хейлопластика, уранопластика взависимости от установленного диагноза.

Уранопластика была проведена в 47случаях, а хейлопластика в 37 случаях. Так же повторное взятие образцаматериала для исследования, было проведено у пациентов, госпитализированныхдля проведения уранопластики после первичной хейлопластики. Оперативное43вмешательство проводилось в операционной Научного центра здоровья детей, г.Москва.Уранопластика по Мамедову была сделана 47 детям (56,0% ДИ: 45,9% 65,7%), Хейлопластика, модифицированный метод: Миллард – Мамедов –Макленнан – 37 (44,0% ДИ: 34,3% - 54,1%), то есть доли обоих вариантовоперации от ½ достоверно не отличаются. Различия по полу, весу при рождении,возрасту, течению беременности и родам не имело статистически значимыхотличий (р>0,05)3.2.

Иммуноферментный анализ матриксных металлопротеиназ 2 типав мягких тканях при различных типах расщелины губы и неба.Приоритетным направлением изучения патогенеза расщелины губы и небаявляется поиск оптимального протокола лечения пациентов, который позволитпройти скорейшую реабилитацию и вернуться к полноценной жизни. Одним изосновныхфакторовмакроорганизмавлияющихявляетсявыборнавосстановлениемоментадляструктурпроведениялицаиоперативноговмешательства.Так же на скорость и качество реабилитации влияет тяжесть общего состоянияпри расщелине губы и неба. Расщелина губы и неба – это заболевание,ассоциированное с нарушениями в соединительной ткани, следовательно,изучение клеточных элементов соединительной ткани и их активности позволитнам сделать определенные выводы.ММП2 учувствует в процессе ремоделирования соединительной ткани,регулируют апоптоз, оказывают влияние на скорость заживления и рубцевания.Следовательно, в эмбриональном периоде данные клеточные элементы приповышенной активности оказывают пагубное влияние на развитие структур губыи неба.

ММП2 играет важную роль во многих нормальных физиологическихпроцессах, таких как эмбриональное развитие, морфогенез, репродукция итканевое ремоделирование. Они также участвуют во многих патологическихпроцессах, таких как воспаление и заживление ран, артрит, рак и сердечно-44сосудистые заболевания. ММП-2 (желатиназа А) широко экспрессируется вовремя развития, и её уровень повышается в местах повреждения тканей.Для выявления уровня ММП2 нами было проведена биопсия мягких тканейиз зоны расщелины и биопсия мягких тканей из максимально удаленного участкаот очага патологии, в пределах операционного поля.

Биопсия проводилась вовремя хирургического вмешательства. Содержание ММП2 в биопсии мягкихтканей, оценено у 84 пациентов с расщелиной губы и неба или расщелиной губы.Таблица 4 – Статистические параметры биохимических показателей ММП2из зоны с патологии и из зоны вне зоны патологии (НП – нет патологии).БелокММП2БелокММП2Показатель (N=84) (мг/мл)нг/мл(мг/мл)НПнг/млНПM0,143,930,152,32m0,060,670,060,47σ0,566,130,534,35Асимм.8,822,358,712,78Эксцесс79,454,9378,17,12Мин0,030,070,030,02Макс5,1626,834,8220,17Процентиль 25%0,050,450,040,3Ме0,061,570,070,59Процентиль 75%0,084,290,12,05В таблице 4 отображены статистические параметры ММП2 для зоныпатологии и параметры, полученные из мягких тканей, полученных из зоны внеочага патологии.

Количество наблюдений 84 (n=84). Из таблицы следует, чтополученные данные имеют широкий диапазон величин. Следует отметить, что вобразцах с патологией по сравнению с контролем мы видим увеличение всехбиохимических показателей по медиане.45ММП2 из зоны расщелины имеет значения от 0,07 до 26,83 нг/мл, гдесреднее значение равно 1,57 нг/мл, 75% значений меньше или равно 4,29 нг/мл,25% равно или ниже 0,45нг/мл. Содержание ММП2 в зоне патологии колебалосьот 0,074 нг/мл до 26,829 нг/мл.ММП2 из зоны без патологии имеет значения от0,02 до 20,17 нг/мл, где среднее значение равно 0,59 нг/мл, 75% значений меньшеили равно 2,05 нг/мл, 25% равно или ниже 0,30 нг/мл.Установлено, что при РГН количество ММП2 в мягких тканях, отличается взоне патологии от количества в зоне без патологии.

Наблюдается достоверныйрост по всем рассматриваемым ферментам, от небольшого увеличения доувеличения в несколько раз. Широкий разброс объясняется различнымсостоянием соединительной ткани при разных видах патологии, тяжестью общегосостояния при различных типах РГН, травматичностью и количеством белка вобразце.Пациенты, принимающие участие в исследовании различались по полу,возрасту, весу на момент оперативного вмешательства, весу при рождении, типуродов, росту, типу проведенной операции, росту при рождении. По всемперечисленнымпоказателямспомощьюкоэффициентовМанн-УитнииКолмогорова-Смирнова достоверной связи с ММП2 в мягких тканях нет.Таблица 5 – Ранговые коэффициенты корреляции значения белка и ММП2 сдругими биохимическими показателями в очаге патологии.Показатель Белок (мг/мл)ММП2 нг/млКоэффициент Знач.