М.В. Медведева - Основные принципы колоночной хроматографии. Гель-фильтрация

УДК 577ББК 28.072М42Рекомендовано к опубликованию решением Ученого и Учебно­методического советов биологического факультета М Г У имени М.В.Ломоносова.Рецензенты:Гусев Н .Б., чл.-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор,заведующий кафедрой биохимии биологического факультета МГУ имениМ.В. ЛомоносоваЕвст аф ьева О.Л., кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимииГОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологическийуниверситет Федерального агентства по здравоохранению и социальномуразвитию.Медведева М.В.Основные принципы колоночной хроматографии. Гель-фильтрация:Учебно-методическое пособие. - М.: Цифровичок, 2012. - 35 с.IS B N 9 7 8 - 5 - 9 1 5 8 7 - 0 5 8 - 0Пособие в первую очередь предназначено для студентов 3-го курсакафедр биофизики, биоинженерии, иммунологии, физиологии человека иживотных, генетики и клеточной биологии и гистологии, выполняющихпрактические работы в рамках раздела «Современные методы биохимии».Оно также может быть полезно для обучения студентов других кафедрбиологического факультета МГУ, осваивающих навыки практическойбиохимии.Учебно-методическое пособиеМЕДВЕДЕВА Марина ВалерьевнаОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ КОЛОНОЧНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ.ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯIS B N 9 7 8 - 5 - 9 1 5 8 7 - 0 5 8 - 0© М едведева М.В., 2012ОГЛАВЛЕНИЕТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ВВЕДЕНИЕ.....................................................1.

Общие принципы хроматографии...................................2. Гель-хроматография............................................................2.1. Принцип метода гель-хроматографии..............2.2. Применение гель-хроматографии.....................2.2.1.

Разделение групп веществ..........................2.2.2. Фракционирование «с высокимразрешением»...............................................2.3. Сорбенты для гель-хроматографии..................2.4. Подготовка носителя к работе............................2.5. Заполнение колонки, нанесение разделяемыхвеществ и их элюция.............................................2.6. Регенерация носителя.ЦЕЛЬ Р А Б О Т Ы ....................................................................................ЗАДАЧИ РА Б О Т Ы ............................................................................Некоторые сведения о разделяемых веществах...........................ПРАКТИЧЕСКАЯ Ч А С Т Ь ...............................................................ОФОРМЛЕНИЕ ЗА Д А Ч И ................................................................Л И Т Е РА Т У РА .....................................................................................344131318181921272728292929303234ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ВВЕДЕНИЕВ данном методическом пособии мы не ставим целью провестиподробный анализ теории хроматографии, а остановимся лишь на техпонятиях и принципах, которые будут непосредственно использованы впрактической работе.1.

Общие принципы хроматографии.Под хроматографическим процессом (хроматография от греч. хрома цвет) обычно подразумевают процесс движения и последующего разделениясмеси веществ в системе, состоящей из двух фаз: неподвижной фазы(которая бывает твердой или жидкой) и подвижной фазы (может бытьжидкой или газообразной). Подвижная фаза движется относительнонеподвижной с определенной скорость и в определенном направлении. Приэтом молекулы фракционируемой смеси веществ распределяются междуэтими фазами в зависимости от своих свойств.Существуетнесколькоосновныхспособовпроведенияхроматографического разделения, среди которых:1) тонкослойная хроматография на пластинах2) хроматография на бумаге3) хроматография в объеме4) колоночная хроматография.Первые дваспособа, как правило, применяютдля разделениянизкомолекулярных соединений, таких как аминокислоты и короткиепептиды, нуклеотиды, липиды и т.п.Хроматография в объеме (подробнее см.

в методичке «Методыразделения и очистки белков») применима для любого вида хроматографии,за исключением гель-фильтрации (см. ниже).Наиболее часто и широко используют различные виды колоночнойхроматографии. Самая простая колонка представляет собой пластиковуюили стеклянную трубку со специальным фильтром на дне, задерживающимсорбент (адсорбент), которым заполняют колонку (рис. 1а). Сорбентпредставлен частицами геля разной химической природы, и поскольку оннеподвижен, является неподвижной фазой. С помощью перистальтическогонасоса на колонку (обычно в верхнюю её часть) подают жидкость, котораясвободно движетсямежду частицами, являясь подвижной фазой элюентом (рис. 1а). В современной колонке герметичность создается за счетадаптеров - специальных поршней, которые плотно прилегают к ее стенкам,и через которые происходит подача раствора (рис.

16).4абРис.1.Хроматографическаяколонка:аобщийвид[http://www.prismreseachglass.com]; б - современная колонка с адаптерами[http://images.google.ru].Хроматографируемые вещества наносят на колонку (наслаивая, или спомощью перистальтического насоса) и подают на неё элю ент , которыйможет захватывать вещества и обеспечивать их перемещение по колонке, т.е.процесс элю ции. Существует несколько вариантов поведения веществ вколонке: 1) все молекулы веществ не взаимодействуют с сорбентом идвигаются по колонке с той же скоростью, что и элюент; 2) вещества прочновзаимодействуют с сорбентом и не могут быть «смыты» - элю ированы —элюентом данного состава, сколько бы его не пропустили через колонку; 3)вещества с умеренной интенсивностью взаимодействуют с сорбентом ипродвигаются по колонке с элюентом, но значительно медленнее, чем егоосновной поток, и в конечном итоге также «выходят» с колонки; 4) частьвеществ прочно связывается с сорбентом, в то время как другие постепенноэлюируются с колонки; или, напротив, 5) часть веществ не задерживается наколонке и движется со скоростью элюента, тогда как остальные веществаэлюируются постепенно; 6) часть веществ прочно связывается с сорбентом, адругие вещества с ним не взаимодействуют вовсе.

С точки зрения разделениявеществ первый и второй варианты развития событий не приемлемы. Всеостальные варианты могут быть использованы при хроматографии.Время, в течение которого молекулы находятся в адсорбированномсостоянии, определяется прочностью взаимодействия с сорбентом. При этомнанесенные на колонку вещества непрерывно распределяются между двумяфазами - подвижной и неподвижной.

Очевидно, что общее количествовещества, подвергающегося хроматографии (М) равноMs + Mm= M ,(1)5гдеM s - количество вещества, связавшегося с сорбентом(моль или мг)М т - количество вещества, не связавшегося с сорбентом(моль или мг).Скоростьмиграциивеществопределятьсякоэффициентомраспределения (К), который равен отношению связавшегося с сорбентомвещества к количеству вещества, оставшегося в подвижной фазе:MsК = ------- ,Мт(2)Если это соотношение для компонентов исходной разделяемой смесине одинаково, то они мигрируют с разными скоростями и их удаетсяотделить друг от друга. При разделении смеси веществ важно подобратьподвижную и неподвижную фазы так, чтобы коэффициенты распределениякомпонентов смеси в них были различными.

Если молекулы вещества совсемне сорбируются на неподвижной фазе, то К=0, а если вещество практическиполностью на ней сорбируется - К—Для веществ с промежуточнымисвойствами величина К может принимать любые положительные значения отО до °о.Движение единичных молекул двух веществ (А и Б) с различнымикоэффициентами распределения схематично представлено на рис.

2а.Естественно, что на практике в колонку не вводятся одиночные молекулы.Средние скорости перемещения отдельных молекул одного и того жевещества немного различаются (согласно распределению Гаусса) (рис. 26),поэтому молекулы разделяемых веществ - сорбатов - «выходят»(элюируются) с колонки не одновременно, а в течение определенногопромежутка времени в некотором объеме.

Эти объемы и соответствующиеим участки длиныколонки, равно как пятна и полосынахроматографической пластине называются хроматографическими зонами, аразличие скоростей перемещения одинаковых молекул - размываниемхроматографической зоны. Это нежелательное явление приводит к тому,что если на колонку нанести два сорта молекул А и Б, то среди молекул Бмогут находиться молекулы А (рис. 26), скорость движения которых близка кскорости наиболее «быстрых» молекул Б.

В результате зоны А и Б могутчастично перекрываться, и разделение окажется неполным (рис. 26). Чтобысвести размывание зон к минимуму, используют различные технические иметодические приемы как на стадии изготовления хроматографическогооборудования, так и на стадии непосредственно хроматографическогоразделения.6абРис. 2. Схематичное отображение поведения молекул двух различныхвеществ ( • ' - А и О - - Б) при колоночной хроматографии (см.

объяснения втексте) [http://www.chromatogramma.ru/book/2009/06/05/teoreticheskie-osnovykhrom atogra...].Размывание хроматографическойзоны на «выходе» с колонкиприводит к постепенному нарастанию концентрации сорбата в элюенте донекоторых максимальных значений,которые значительно меньшеконцентрации этого же вещества на «входе» в колонку, и таким жепостепенным спадом концентрации до нулевого уровня. Такие единичныеконцентрационные зависимости для каждого разделяемого веществавреальном времени называются хром ат ограф ическим и пикам и, а точка снаибольшей концентрацией вещества - м аксим ум ом пика (рис.