Методы разделения и очистки белков, страница 11

На первом этапепроводят электрофорез белков в полиакриламидном геле вденатурирующ их условиях (в присутствии ДСН). Далее вэлектрическомполебелкипереносят,какправило,нанитроцеллюлознуюилиполивинилидендифторидную(PVDF)мембрану. Искомый белок выявляют с помощью специфичных кнему первичных антител, которые для осуществления детекциилибо сами могут быть мечены какой-либо меткой, либо требую тиспользованиявторичныхантител(антителк первичнымантителам), меченныхфлуоресцентной, радиоизотопной илиферментной меткой. Появление положительного специфичногосигнала на мембране свидетельствует о безусловном наличииискомого белка в полученном препарате.55Одним из наиболее точных методов идентификацииполученного в процессе выделения белка является метод массспектрометрии. Этот метод основан на определении его массы (ш)или чаще, отношения массы к заряду (m/е). Одним из методов массспектрометрииявляетсяМАЛДИматричнаялазернаядесорбционная ионизация. Ионизацию белковой пробы проводят спомощью импульсных лазеров.

По спектру регистрируемых ионовможно получить точную и исчерпывающ ую информацию омолекулярной массе белка или его фрагментов, что позволяетидентифицировать белок.И дентифицироватьполученныйбелокможнотакже,определив его аминокислотную последовательность.Такоеопределение включает несколько стадий: расщ епление белка насоставляю щиеегоаминокислотыиопределениеобщегоаминокислотного состава белка, определение N- и С-концевыхаминокислотных остатков, расщ епление полипептидной цепи нарядпептидовразличнымиспособамииустановлениеаминокислотнойпоследовательностиэтихпептидовпоперекрывающимся фрагментам.Помимо перечисленных выше тестов, для ферментовкритерием их чистотыслужит высокая величина удельнойактивности.Полученные вышеперечисленными методами положительныерезультаты позволяют с большой вероятностью утверждать, чтовыделенный в процессе очистки белок гомогенен.

Однако они, какправило, не позволяют выявить примеси, составляю щ ие менее 1%.56ВЫ ДЕЛЕНИЕ ЯИ Ч Н О ГО АЛЬБУМ И НАЦЕЛЬ РАБОТЫ:Целью данной работы является выделение и очистка яичногоальбумина.ЗАДАЧИ РАБОТЫ:1) Выделить альбумин из яйца кур с помощью различныхметодов фракционирования.2) Очистить яичный альбумин до электрофоретическигомогенного состояния с помощью ионообменнойколоночной хроматографии.Некоторые сведения о белке.Альбумины простые глобулярные белки, хорошорастворимые в воде, солевых растворах, разбавленных кислотах ищелочах.

Они выпадаютв осадок при насыщении растворасульфатом аммония свыше 50%.Яичныйальбумин(овальбумин(альбуминяиц),идентификационный номер в базе данных Swiss-Prot Р01012) основной компонент белка яиц, на долю которого приходитсяоколо 64% от общего белка. Он состоит из 385 аминокислотныхостатков, и его молекулярная масса составляет около 43 кДа, аизоэлектрическаяточкаравна5,19(определеныпоаминокислотномусоставу).Известно,чтоовальбуминподвергается различным посттрансляционным модификациям,таким как гликозилирование (имеет 4 участка гликозилирования),фосфорилирование и ацетилирование N -концевого остатка.Овальбумин используется для питания зародыш а яйца.

Онбыл одним из первых белков, полученных в кристаллическом видееще в конце XIX века, и с тех пор является одним из наиболееизлюбленных объектов для исследований структуры и свойствбелков.Наряду с яичным альбумином, среди других белков яйцаприсутствуют лизоцим, кональбумин, рибофлавинсвязывающ ийбелок, основные свойства которых представлены в таблице 4, атакже некоторые минорные белки.Существует множество способов очистки яичного альбуминаот других белков яйца. Наиболее простой и доступный из них очистка белка с помощью ионообменной хроматографии наДЭАЭ-целлюлозе.57ДЭАЭ-целлюлоза (диэтиламиноэтилцеллю лоза) - слабыйанионообменник (рКа=9,5). Процесс, протекающий на данномсорбенте, можно схематично представить в виде следующейсхемы:М— 0 -C H 2CH2-N+H(C2H5)2 —А' + х: <-* м— о-сн сн2N +H (C 2H5)2- X ' + А'где М - матрица сорбента (целлюлоза)X ' - отрицательно заряженные белкиА’ - уравновешивающий анион2Взаимодействие белка с сорбентом можно ослабить,увеличивая ионную силу буфера, поступающ его на колонку.

Чемсильнее взаимодействие белка с анионообменником (чем большеотрицательный заряд белка при данном значении pH буфера), тембольшая ионная сила необходима для элюции белка с колонки.Таблица 4. Некоторые основные теоретически рассчитанныефизико-химические свойствабелков куриного яйца (по базеданных Swiss Prot (http://au.expasv.org/sprot/)).мН азваниебелкаЯ ичны йальбуминЛ нзоцим)G)0)К ональбуминРибофлавин-связы ваю щ ийбелокН омерв базеданны хSw issProtР01012Кол-воам и н о­к ислотМ олеку­лярнаямассабелка,386Ля42750П оглощ ениераствора сконц-цисй1 мг/мл при280 нм0,741/0,732**Р*5,19Р00698*147162392,338/2,3079,36Р02789705777771,135/1,1096,85Р02752238272111,747/1,7065,13* - предшественники белков** - две цифры указывают на поглощение раствора белка,молекуле которого все остатки Cys окислены/восстановлены58ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ (работа в паре)Занятие 1.1.

Приготовление реактивов.Реакт ивы :1. Куриное яйцо - 1 шт.2. Насыщенный раствор сульфата аммония, pH 7,5-8,0 - 50 мл(готовый реактив)3. 0,5 М серная кислота - 10 мл (готовый реактив)4. 100 мМ раствор трис-HCl буфера, pH 7,5 - буфер А - 700мл5. 25 мМ раствор трис-HCl буфера, pH 7,5 - буфер Б - 2800мл (готовят из буфера А)6.

Трис-HCl буфер, pH 7,5, содержащ ий 0,05 М NaCl - буферВ - 100 мл (готовят из буфера Б)7. Трис-HCl буфер, pH 7,5, содержащий 0,2 М NaCl - буферГ - 100 мл (готовят из буфера Б)8. Трис-HCl буфер, pH 7,5, содержащий 0,5 М NaCl - буферД - 100 мл (готовят из буфера Б)9. 1 М раствор NaCl - 50 млЮ .ДЭАЭ-целлюлоза (25-30 мл)Приготовление реактивов (см. выше) начнитенеобходимых для уравновеш ивания колонки.срастворов,2. Подготовка сорбента к ионообменной хроматографии.1. Заполнение колонки.Для успешного разделения исследуемых веществ большоезначение имеет правильное заполнение колонки.1) Укрепите колонку в ш тативе строго вертикально.2) Закройте снизу кран и заполните колонку водой примерно на1/3 объема.

Если необходимо, с помощью ш прица освободитепространство под пористым диском от пузырьков воздуха.3) Через воронку или по палочке заполните колонку густойсуспензией тщ ательновзмученного сорбента (ДЭАЭцеллюлозы) так, чтобы его конечный объем составил -1 5 мл(считаем, что объем колонки равен ~ 15 мл). Подумайте,какими способами мож но точно определить, до какогоуровня необходимо залить суспензию сорбента в колонку,59чтобы его объем составил 15 мл, если диаметр даннойколонки 2,5 см.4) Дайте суспензии осесть и при необходимости добавьте ещепорцию сорбента, взмутив стеклянной палочкой верхнийслой уже осевшего носителя и открыв колонку снизу.

Чтобыво время хроматографии верхний слой сорбента невзмучивался, на него можно положить кружок изфильтровальной бумаги.5) Плотно закройте крышку колонки так, чтобы колонка былаполностью герметична.6) П одсоедините колонку к перистальтическому насосу, спомощью которого вы будете задавать скорость токажидкости через колонку.7) Определите скорость тока жидкости через колонку.Оптимальная скорость для данного разделения (при диаметреколонки 2,5 см) - 80 мл/ч. Убедитесь, что ваша колонкавыдерживает такую скорость (уровень жидкости и сорбента вколонке должны быть постоянными).2.

Уравновеш ивание колонки.1) Для того чтобы уравновесить сорбент анионами, которыевпоследствии будут «обмениваться» на белки, нужно заранеепропустить через колонку примерно 10 объемов буфера Б, вкотором вы будете наносить белок на колонку.Во время уравновешивания сорбента буфером Б целесообразноприготовить другие реактивы для выделения белка и провестисеминар.Семинар по очистке белков.2) Убедитесь, что колонка уравновеш ена, измерив pH иэлектропроводность буферных растворов, подаваемых ивытекающих из колонки. Колонку уберите в холодильник доследующего занятия.Занят ие 2.

Выделение яичного альбумина из куриного яйца.На всех эт апах выделения не забы вайт е отбиратьпробы (-5 0 -6 0 мкл) для последующ его анализа методом60элект рофореза в полиакриламидном геле. Все от обранны ефрикции обязательно подпиш ит е и заморозьте.1) Возьмите одно яйцо и отделите белок от желтка.Определите объем полученного белка.2) К белку при постоянном перемешивании на магнитноймешалке с помощью пипетки Пастера добавьте равный объемнасыщенного раствора сульфата аммония, pH 7,0-8,0 и оставьте,перемешивая, на 30 минут при комнатной температуре дляформирования осадка.3) Суспензию центрифугируйте 15 минут при 10000 g(t=+4°C).4) Осадок глобулинов отбросьте, а к супернатанту приперемешивании, измеряя pH на рН -метре или с помощьюиндикаторной бумаги, добавьте по каплям 0,5 М раствор сернойкислоты до pH 4,5-4,6.

Оставьте суспензию, перемешивая намагнитной мешалке, на 30 минут при температуре +4°С дляформирования осадка.5) Осадок отделите центрифугированием (10000 g, 15минут, t=+4°C) и растворите в небольшом объеме буфера Б.6)Определитеконцентрациюбелкавраствореспектрофотометрическимметодом,считаякоэффициентудельногопоглощенияравным1 (Подумайте,почемупредлагаетсяиспользоватькоэффициентудельногопоглощения, равный 1, а не 0,74 (табл.)). Рассчитайтеколичество белка, полученного на данном этапе выделения.7) Раствор белка заморозьте или поставьте на диализ.Заранее обсудите этот этап работы с преподавателем.Занят ие2 а.хромат ограф ии.Подгот овкапрепарат абелкакБелковый раствор, полученный на предыдущем этапевыделения и требующий дальнейш ей очистки на ионообменномсорбенте, нужно предварительно отдиализовать. (Подумайте,почему это необходимо сделать).Лучше, чтобы концентрация белка при диализе непревышала 15-20 мг/мл, так как при понижении ионной силы впроцессе диализа некоторые белки, присутствующие в растворев больших концентрациях, могут образовывать агрегаты.

Вслучае необходимости разведите белковый раствор буфером Б.61Поместите белок в диализный меш ок и диализуйте против1 литра буфера Б на холоду (в холодной комнате) при хорошемперемешивании. Через 4-5 часов смените буфер и диализуйтебелок еще 5-10 часов против 1 л буфера. (Подумайте, почемубелок лучше диализовать со сменой буфера (2 ра за против 1 лбуфера, а не 1 р а з против 2 л)).Есливы диализуете раствор белка не наканунехроматографии, а заранее, диализованный раствор заморозьте.Занят ие 3.

П роведение ионообменной хромат ографии.Исходя из емкости данного сорбента, на колонку с ДЭАЭцеллюлозой объемом 15 мл можно нанести -3 0 0 -3 5 0 мг белка.I.Подгот овка диализованного белкового раст вора кхром ат о граф и и.1) Если после диализа в растворе белка появился осадокденатурированных белков, раствор перед нанесением на колонкунужно отфильтровать через бумажный фильтр, предварительносмоченный водой. Только прозрачный раствор белка можнонаносить на колонку.2) Для того чтобы определить, какой объем раствора белканужно нанести на колонку, измерьте его концентрациюспектрофотометрическим методом. (Подумайте, почему неследует пользоваться данными определения концентрациибелка до диализа).3) Перед нанесением раствора белка на колонку повозможности оцените ионную силу раствора белка поэлектропроводности и сравните ее с ионной силой буфера,которым уравновешена колонка.